社区

     目前国内外血清/血浆miRNA提取试剂盒种类繁多，标准操作流程中也大多提及到样本的最小和最大投入量，但是关于样本最大投入量下的产品效果验证无论是在官网还是相关产品的宣传资料中都很少报道。我们都知道血浆基质复杂，稍大样本量的投入会大幅增加RNA共提取PCR抑制剂的风险，此类抑制剂会大大降低逆转录和PCR的扩增效率，最终抵消样本量提升带来产品增益。鉴于近期Anouve血浆miRNA提取试剂盒在样本投入量的参数上有了一定的优化（提升至600uL），现向各位看官汇报600uL血浆投入量下的测试结果。 

“实验分为两个流程： 

• 300uL和600uL血浆裂解后分别加入等量的cel-miR-39（参考Q Company miRNeasy外参加入要求），监测提取和纯化流程的一致性，同时评估两倍血浆体积的输入，能否带来内源miRNA的总体回收增益。

• 300uL和600uL血浆miRNA提取后-逆转录前向RNA中加入等量的外参，同时以无核酸酶水为基线对照加入同样等量的外参，评估RT和PCR抑制性。

流程1结果展示：

结果提示（图1）： 不同体积血浆裂解后加入等量的外参,虽然其Ct值在两组间存在约0.7Ct的均值差异，但600uL组均未发现外参Ct值升高。其次因样本量较小，目前暂不能确定该波动为系统性差异（图1）。所以，图3将内源靶标未经外参矫正和经外参矫正的相对miRNA信号（600uL/300uL）一并展示给大家。

结果提示（图2）：600 µL组内源miR-16和miR-150的Ct值均低于300 µL组，因样本数量有限，这里暂不做统计分析（图2）。

图3.600uL vs 300uL相对miRNA信号

结果提示（图3）：无论是否引入外参校正，两种分析结果的呈现均显示600 µL组内源miRNA信号高于300 µL组且结果方向一致。

流程2结果展示：

图4.核酸洗脱后加入等量外参的Ct值呈现

结果提示：核酸提取完成后、逆转录前向各反应加入等量cel-miR-39。600 µL组与300 µL组外源质控平均仅相差0.18 Ct，且与无核酸酶水对照结果接近，未提示明显RT-qPCR抑制。

图5.内源靶标在不同血浆体积下的Ct值呈现 

“结论

     血浆加量以后，最怕的不是“提得少”，而是“杂质把增益吃掉”。从本次测试来看，这种担忧暂未出现。在本次混合血浆池、统一50 µL洗脱体积的测试条件下，将血浆投入量由300 µL提高至600 µL后，未观察到明显的提取过载或下游RT-qPCR抑制。裂解阶段外源质控在600 µL组未出现Ct升高；尽管其与300 µL组存在约0.70 Ct的均值差异，但受限于当前独立提取重复数量，尚不能判断该差异是否具有系统性。内源miR-16和miR-150在两个实验流程中均表现为600 µL组Ct降低、可扩增信号增强；无论是否采用裂解外参校正，结果方向一致。

     提取后、逆转录前加入的外源质控与纯水对照Ct接近，进一步表明从600 µL血浆中提取的核酸在当前投入条件下未产生明显RT-qPCR抑制。上述结果初步支持Anouve血浆miRNA提取试剂盒对600 µL血浆投入量的兼容性，并显示增加样本投入量能够为内源miRNA检测带来实际信号增益。需要说明的是，本次属于基于单一混合血浆池的小样本方法学测试，尚不能据此证明严格的线性回收关系，后续仍需结合更多独立血浆池、不同样本来源及低丰度靶标进一步验证。

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