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ADC药物

抗体偶联药物（Antibody–Drug Conjugates, ADC）是一类将具有细胞杀伤能力的小分子药物偶联到特异性识别抗原的抗体上的药物。近年来，ADC药物技术被应用于治疗多种类型的肿瘤疾病。按照目前的发展趋势，ADC药物市场份额将持续增长。

相较于抗体药物（Monoclonal Antibody, mAb），ADC药物有更高的复杂性，在此类药物的生产过程中除涉及抗体药物生产的全部过程外，还包括对抗体的偶联修饰过程。因此，ADC药物的质量表征不仅需要研究抗体本身，还需要进行更多维度的表征如DAR值表征、偶联位点分析等。

虽然距离第一个ADC药物Mylotarg首次上市已经过去了20多年，我们对ADC药物的理解也有了长足的进步，但是开发一款有效的全新ADC药物分子仍然不是一件简单的事情。对于这类药物分子的开发，除了需要进行单抗药物本身的开发外，还要考虑连接子设计和载药的选择，这样使得ADC药物的开发难度更高。

本系列文章基于东曜药业在ADC药物领域多年的分析研究经验，对ADC药物关键质量属性表征和监控方法进行整理和呈现。

ADC药物偶联位点异质性表征策略  

如本系列文章一所展示，对于ADC药物，不同的偶联位点及偶联过程都会导致 ADC 分子在载荷及分布上的异质性（如图1所示），从而影响药效和安全性。目前有多种分析方法可以在完整质量水平测定药物抗体比（Drug-to-Antibody Ratio, DAR），来实现ADC整体药物负荷及分布的表征分析，保证ADC药物的安全有效并支持开发生产过程中的工艺优化。而深入表征发生偶联的确切位点及偶联位点的载荷分布，则需要通过LC-MS/MS平台，运用肽图实现。

图1 ADC药物偶联方式：（a）基于半胱氨酸的偶联反应 （b）基于赖氨酸的偶联反应 （c）位点特异性偶联反应[1]

LC-MS/MS肽图分析  

LC-MS/MS肽图分析作为一种重要的分析工具，被广泛地应用于大分子药物表征研究中，来获得分子一二级结构信息，酶解后的肽段样品经液相色谱分离后进入高分辨质谱进行分析，通过特定的离子解离方式获得有规律的二级离子（图2），依据已知序列数据库和采集的质谱数据经由数据处理软件进行匹配，实现肽段序列信息的确认。同时, 对于肽段上可能存在的修饰，考虑发生修饰后导致的质量差异，通过对比天然肽段和发生修饰肽段一二级质谱数据，就可以识别修饰的发生及发生的位点。对于ADC药物，偶联的drug-linker也可以看作是可变修饰，参考表征分析中PTM的分析策略进行，但由于drug-linker相比常见的PTM修饰（氧化、脱酰胺）分子量更大，结构也更复杂，因此，在目前常见的HCD/CID解离模式下，drug-linker会发生碎裂而无法完整保留在肽段上，同时也可能会影响肽段序列酰胺键的解离效率，所以在数据分析时通常需要在软件搜索的同时，结合手动确认策略，来保证对发生偶联肽段的识别。总结来说，基于LC-MS/MS的偶联位点分析，一般流程如图3所示，下面就以典型的ADC药物分子为代表进行进一步展示。

图2 肽段在不同解离技术下的特异性解离方式[2]

图3 偶联位点分析一般流程

偶联位点的筛选及识别  

以Kadcyla为例，DM1毒素分子通过SMCC连接子连接到曲妥珠单抗序列中赖氨酸残基上，形成drug-linker后会造成+956.36Da（MCC-DM1）的质量差异，就可以通过质谱数据处理软件分析肽图数据时, 将MCC-DM1作为可变修饰进行设置，进行软件的自动检索，同时通过偶联反应导致的其他差异进行手动数据确认。

（a）色谱行为：偶联疏水药物后，在RPLC色谱模式下，发生偶联的肽段相比未偶联肽段保留时间增加，同时通过马来酰亚胺连接的MCC-DM1存在两种立体构型，导致偶联肽段成对出峰（图4）。

（b）偶联DM1会阻止相应Lys位点的Trypsin酶解，所以发生偶联的肽段会包含一个漏切位点（除随后C端为Pro外）。

（c）DM1在二级解离过程中会产生特征碎片（图5），偶联肽段的二级质谱图中就会包含DM1特征碎片离子，典型图谱如图4。

在软件检索的基础上，结合以上手动确认的策略，就能对发生偶联的肽段进行准确的鉴别。

此外，由于ADC偶联方式的差异以及Linker及可选的毒性小分子的多样性，不同的ADC药物分子都会有自己独特的情况，需要根据实际的ADC分子结构制定合适的偶联肽段筛选方案。

图4 Lys-MCC-DM1偶联肽段典型图谱（a）偶联肽段XIC图谱，成对出峰 （b）偶联肽段一级质谱图谱（c）偶联肽段二级质谱图谱

图5 DM1分子二级解离途径[3]

偶联位点偶联水平分析  

在确认发生偶联的位点后，可以对每个偶联位点的偶联程度进行评估，目前也有一些报道探讨关于偶联水平的计算方式[4-5]。整体来说，通过LC-MS/MS评估每个偶联位点的偶联程度，有以下几个需要额外考虑的方面：

（a）依据质谱响应计算偶联水平时，需要考虑由于drug-linker引入导致的偶联及未偶联肽段之间质谱离子化差异，同样的，不同肽段之间离子化效率也有差异。因此，基于质谱响应计算的偶联程度, 无法完全代表真实的偶联程度，但对于批次之间的比较仍非常可靠。

（b）由于drug-linker的多样性，当采用的drug-linker疏水性较大时，还需要考虑偶联肽段在肽图样品前处理中由于疏水性导致的损失。对此，可以通过优化前处理过程，在样品处理中添加合适比例的有机溶剂来保证疏水组分的溶解性[6]，以半胱氨酸偶联ADC疏水偶联肽段在不同前处理方式中的差异加以说明（图6）。常规的肽图前处理流程下，携带两个MMAE分子的铰链区肽段（THTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPK）相比优化后流程有明显的损失。

（c）肽图样品在进入质谱质量分析器之前，需要在离子源高温高电压的条件下实现离子化，这一过程中可能会导致drug-linker在离子源内发生解离。对于容易发生源内解离的这一类ADC分子，一方面可能需要调整离子源条件，控制drug-linker在离子源内的解离程度，另一方面，也可将drug-linker丢失断裂部分后的剩余分子作为可变修饰，在软件检索时进行设置，既可以辅助偶联位点的精确识别，也可以在计算偶联程度时, 使计算结果更准确。

图6 Cys-MMAE偶联肽段二级质谱图谱（a）及在肽图前处理中存在的损失（b）

偶联副反应分析  

在ADC偶联反应的过程中，除了理论的偶联位点，也可能会存在不在预期范围内的副反应。例如基于半胱氨酸偶联的反应，通常会通过半胱氨酸-SH和马来酰亚胺基团的反应进行链接，而抗体上除了预期的半胱氨酸-SH外，抗体序列中部分伯胺基团（-NH2）在合适的条件下, 也可能会和马来酰亚胺进行反应，从而导致副反应的产生。通过肽图水平的LC-MS/MS分析，也可以实现对于副反应位点的鉴别和检测，从而保证ADC药物的安全有效。图7展示了基于半胱氨酸偶联的ADC分子，发生在赖氨酸-NH2的副反应图谱，通过二级质谱数据中肽段序列b、y离子及偶联小分子MMAE特征碎片, 确认了副反应的发生及位点。

图7 基于Cys通过马来酰亚胺基团进行偶联时存在的发生在Lys的偶联副反应

小结  

东曜药业在ADC领域深耕多年，拥有多名表征分析经验丰富的研发人员, 质谱分析平台现有岛津LCMS-8060三重四级杆液质联用仪、AB SCIEX QTOF高分辨液质联用仪、Vanquish Flex -Thermo QE高分辨液质联用仪，可以在各个阶段通过完整质量以及肽图水平分析来支持ADC分子的全面结构表征。此外, 东曜药业在CMC开发方面有丰富的经验，已支持多个不同ADC技术的药物在不同阶段，包括临床前以及上市前工艺验证阶段的分析和表征研究，助力CDMO项目更快更好地落地。

参考资料

[1] Leung D, Wurst J M, Liu T, et al. Antibody Conjugates-Recent Advances and Future Innovations[J].Antibodies, 2020.

[2] Artemenko K, Mi J, Bergquist J. Mass-spectrometry-based characterization of oxidations in proteins. Free Radic Res. 2015.

[3] Sang, H., Wan, N., Lu, G., Tian, Y., Wang, G., Ye, H. (2020). Conjugation Site Analysis of Lysine-Conjugated ADCs. In: Tumey, L. (eds) Antibody-Drug Conjugates. Methods in Molecular Biology.

[4] Chen L, Wang L, Shion H, et al. In-depth structural characterization of Kadcyla (ado-trastuzumab emtansine) and its biosimilar candidate [J]. mAbs, 2016.

[5] Luo Q , Chung H H , Borths C , et al. Structural Characterization of a Monoclonal Antibody–Maytansinoid Immunoconjugate [J]. Analytical Chemistry, 2015.

[6] Said N, Gahoual R, Kuhn L, Beck A, François YN, Leize-Wagner E. Structural characterization of antibody drug conjugate by a combination of intact, middle-up and bottom-up techniques using sheathless capillary electrophoresis - Tandem mass spectrometry as nanoESI infusion platform and separation method. Anal Chim Acta. 2016.

关于东曜药业股份有限公司（股票代码：1875.HK）

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公司于2019年在香港联交所主板上市，2021年全面转型，致力于成为全球药物开发领域专业CDMO合作伙伴，提供生物药开发到生产一站式解决方案。

东曜药业拥有从研发、工艺开发、临床试验、注册报批到商业化生产的全流程经验，建立了完整的ADC技术平台，具备核心偶联工艺和放大的技术优势，以及ADC关键质量属性的自主分析能力，保证产品高质量开发。

在生产方面，东曜药业拥有多条符合GMP标准的集抗体、ADC原液及制剂于一体、国内产能领先的OEB-5级别ADC CDMO商业化生产线，避免了中国与其他国家对于分段生产议题上的法规不确定性风险，抗体产能达万升级以上，并有商业化产品在线生产。

在质量体系方面，东曜药业质量管理体系满足中国/美国/欧盟申报要求，通过国家药品注册生产现场和GMP质量管理体系核查，具有丰富的产品上市注册核查经验，已为客户提供数十个抗体及ADC项目的中美欧工艺开发、临床申报及生产服务。

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