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个性化新抗原肿瘤疫苗的研究进展

前言 疫苗传统上用于预防传染病;然而,这种药物诱导和扩增抗原特异性免疫反应的能力长期以来被认为是治疗癌症的一种潜在的有价值的工具。早期治疗性疫苗接种策略集中于肿瘤中异常表达或过度表达的自身抗原,称为肿瘤相关抗原( TAA ),然而这种策略由于TAA特异性T细胞受中枢和/或外周耐受的影响,临床基本上是不成功的。另外,这种TAAs在非恶性组织中也有一定程度的表达,这增加了疫苗诱导自身免疫毒性的风险。 肿瘤细胞中发生的突变可以产生新的自身抗原表位,称为新表位或新抗原。基于新抗原而非传统TAAs的疫苗有几个优点。首先,新抗原仅由肿瘤细胞表达,因此可以引发真正的肿瘤特异性T细胞反应,从而防止对非肿瘤组织的“脱靶”损伤。第二,新抗原是源于体细胞突变的新表位,它有可能绕过T细胞对自身表位的中心耐受,从而诱导对肿瘤的免疫反应。此外,这些疫苗增强的新抗原特异性T细胞反应持续存在并提供治疗后免疫记忆的潜力,这为长期预防疾病复发提供了可能性。免疫原性新抗原的鉴定 为了识别肿瘤特异性的体细胞突变,从患者身上采集肿瘤活检样本和非肿瘤组织样本( 通常是外周血单个核细胞 ),以进行肿瘤和种系DNA的全外显子序列测定。另外,RNA测序提供了关于突变基因表达和进一步确认突变的有效信息。根据肿瘤类型,通常可以识别出大量肿瘤特异性突变;然而,并非所有突变都会导致新表位被免疫系统识别的,这是由于HLA的限制。已知HLA-A、HLA-B、HLA-C等位基因共有16000多个,因此,在预测潜在的免疫原表位的时候,需要考虑HLA分型。 用计算方法预测MHC-I结合表位,与HLA有较强亲和力( IC 50 <150 nmol/l )的肽被认为更有可能诱导CD8+T细胞应答。目前,各种预测MHC-I递呈表位的各种计算方法已被开发,包括利用质谱进一步改进预测算法。然而,迄今为止,表位预测方法主要集中在MHC-I结合表位上,MHC-II更具弹性的结合表位使其表位预测更加复杂。 除了计算方法之外,诱导新抗原特异性免疫反应的另一种方法是使用肿瘤裂解物。自体APCs,通常是DCs,可以从患者体内分离出来,暴露于肿瘤溶解物中,然后再注射回患者体内,目的是刺激对TAAs或新抗原的免疫反应。这种方法避开了鉴定患者特异性新抗原所需的测序和计算分析。然而,TAAs不太可能具有免疫原性,此外,由于非免疫原性自身抗原的丰度较高,可能降低相关新表位刺激免疫反应的能力。免疫原性新抗原的质量 新抗原平台的成功在很大程度上取决于肿瘤突变负荷( TMB ),可以合理地假设TMB高的肿瘤可能具有相应的高数量的肿瘤新抗原,可用于疫苗靶向,并对ICI有更好的反应。 然而,高TMB的发生并不总是与ICI的反应一致。除了肿瘤内在的耐药机制,造成这种差异的其他原因可能直接与新抗原的“质量”有关,即新抗原对肿瘤产生最终TH1细胞和/或CTL反应的能力。 新抗原的“质量”包括:(1)外源度,即衡量新抗原与野生型蛋白质相比的异源性,内源性越强免疫原性越弱,越容易通过免疫耐受清除;(2)克隆分布,克隆突变导致大多数肿瘤细胞表达新抗原,而低分布的突变更可能在ICI的选择压力下失去表达;(3)肿瘤的突变状态,相比于乘客突变,驱动突变更不容易发生逃逸; (4) MHC递呈分子的亲和力与表达;(5)TCR与MHC复合物的亲和力。新抗原疫苗方案的考量 在设计治疗性疫苗接种方案时应考虑多种因素。 在样本收集之后,生成个性化疫苗所需的时间是一个关键因素,特别是在转移性疾病环境中; 生产时间取决于疫苗平台的选择,然而,在设计和制造个性化疫苗的同时,可以对患者实施组合疗法,以培养有利的免疫环境。 也可以在接种疫苗时或接种疫苗后给予辅助治疗,以增强免疫反应。 其他变量包括疫苗和任何联合疗法的给药途径,以及加强疫苗接种的数量。在疾病复发的情况下,可以重复进行肿瘤DNA测序,疫苗诱导的T细胞反应可以通过血液和肿瘤样本来评估,从而为后续治疗提供决策依据。新抗原疫苗的临床进展 目前,已有多个性化新抗原疫苗临床试验中在进行中,这些初步研究为个性化新抗原肿瘤疫苗的免疫原性和治疗潜力提供了重要的线索。 这些初步的临床试验大多在所有肿瘤都已手术切除,没有任何额外的标准治疗情况下进行,仅能使用试验疫苗。鉴于针对PD-1或PD-L1的ICI在癌症中具有广泛的临床疗效,个性化新抗原疫苗联合PD-1或PD-L1抑制剂是目前的发展方向。多个正在进行的临床试验正在将个性化新抗原疫苗与PD-1、PD-L1和/或CTLA4抑制剂在不同肿瘤类型联合应用。 GEN-009 是一种个性化的新抗原疫苗,包含 4-20 个使用 ATLAS 表位发现平台选择的合成长肽,使用 poly-ICLC 制剂。 在一项正在进行的多中心 I/IIa 期研究( NCT03633110 )中, 8 名具有高复发风险的实体瘤患者接受了 GEN-009 ,对疫苗的耐受性良好,仅报告了局部注射部位的不适。 发现所有患者对至少一种新抗原有外周血 CD4+T 细胞和 CD8+ 反应, 99% 的肽刺激 T 细胞反应,值得注意的是, T 细胞反应通常持续 12 个月以上。 这项试验的进一步数据还包括一组晚期疾病患者,他们正在接受 GEN-009 与 PD-1 抑制剂的联合使用。 RO7198457 是一种编码多达20种新抗原的个性化RNA-lipoplex新抗原疫苗,在Ib期研究中(NCT03289962),对132例晚期实体肿瘤患者进行了与atezolizumab的联合试验。结果显示,77%的患者在体外检测到循环T细胞对中位数为2.6的新抗原的反应。在外周血中检测到疫苗特异性CD8+T细胞的频率>5%,在接种后的肿瘤标本中也检测到疫苗特异性TCR。 mRNA-4157 是另一种脂质包裹的RNA新抗原疫苗,已在13例高危可切除实体瘤患者中作为单一疗法进行试验,并与pembrolizumab联合治疗20例不能切除的晚期实体瘤患者,后者包括12名在ICI治疗前有疾病进展的患者(NCT03313778)。未观察到剂量限制性毒性或3-4级不良事件。在联合治疗的20名患者中观察到6项临床反应(ORR 30%),其中包括12名先前接受ICIs治疗的患者中的2名(17%)。新抗原疫苗的挑战 尽管部分新抗原疫苗初步临床试验数据显示出强有力的免疫原性和靶向肿瘤细胞杀伤的证据,但相对更大比例的疫苗新表位没有刺激T细胞反应。癌症疫苗研究领域的首要挑战是提高我们对如何诱导T细胞应答,特别是CD8+T细胞的最大激活和扩增的能力。 为了实现这一目标,可能需要促进APC功能和淋巴结中T细胞最佳启动的补充疗法。有可能实现这一点的包括ICIs、共刺激受体激动剂( 如CD40 )、TLR激动剂和支持DC发育和/或功能的生长因子( 如GM-CSF )和Fms相关酪氨酸激酶3配体( FLT3L )。 另一个挑战是如何确定疫苗递送系统,使疫苗能够快速、经济有效地生产,从而及时部署。不同的疫苗形式,包括肽、RNA、DNA、病毒结构或DC,各有优缺点;然而,缺乏对这些不同方法在患者中的头对头比较。 ICI给药和治疗性疫苗接种的时间是另一个重要考虑因素。将ICIs与治疗性疫苗接种方案相结合可能是有益的,但需要仔细考虑最合适的成分治疗惯序。小结 快速而全 面地鉴定肿瘤特异性突变的能力为肿瘤疫苗领域提供了长期难以找到的肿瘤特异性靶点。 初步研究表明,个性化的新抗原疫苗可以为肿瘤患者带来显著的临床收益,但个性化的新抗原肿瘤疫苗仍面临诸多挑战,最终我们需要开发稳定、安全并能够最大程度诱导 T 细胞应答的治疗策略。 目前,许多利用不同疫苗递送平台和联合疗法的研究正在进行中,结果值得期待。来源:小药说药
个性化新抗原肿瘤疫苗的研究进展

BRCA1/BRCA2突变的致癌能力被低估了

在20世纪90年代,研究人员证明了BRCA1和BRCA2为遗传性乳腺癌和卵巢癌的致病基因[1]。时至今日,我们都知道携带BRCA1和BRCA2基因突变的人群患乳腺癌和卵巢癌的风险增加,且BRCA1和BRCA2突变携带者患乳腺癌的风险与被诊断为乳腺癌的近亲数量呈正相关[2]。随着对这两个基因研究的深入,人们发现在前列腺癌和胰腺癌中,BRCA1和BRCA2致病性突变频率也增加,因此与这两个基因有关的癌症类型进一步扩展[3-4]。在一些病例对照研究中,还报道了BRCA1/BRCA2突变与胆管癌、宫颈癌、结直肠癌等癌症类型的相关性,但存在样本量较小等局限[5-8]。为了进一步探索与BRCA1/BRCA2致病突变与癌症的关系,日本理化研究所(RIKEN)综合医学科学中心桃沢幸秀(Yukihide Momozawa)教授团队,对14种常见癌症类型共63828例患者和37086例对照进行了大规模测序,发现BRCA1/BRCA2致病性突变与至少7种癌症风险增加有关[9]。除了与已知的四种癌症相关,BRCA1致病性突变携带者患胆管癌的风险是未携带者的17.4倍,BRCA2致病性突变携带者患食管癌的风险是未携带者的5.6倍。此外,携带BRCA1或BRCA2致病性突变的个体患胃癌的风险分别为未携带者的5.2倍和4.7倍。这一研究近日发表于JAMA OOncology。论文首页截图研究收集了日本生物库2003年4月至2018年3月之间,患有14种不同类型癌症的65108例患者和37086例对照的样本,并进行测序,分析了BRCA1和BRCA2编码区和侧翼序列中的突变,其中致病和可能致病的突变统称为致病性突变。通过对临床信息的分析,研究人员发现,不同癌症的平均诊断年龄各不相同,如确诊宫颈癌的平均年龄为49.7岁,确诊前列腺癌的平均年龄达到70.2岁。高达28.1%(3010例)的胃癌患者有家族史,子宫内膜癌患者有家族史的比例最低,仅占2.4%(46例)。患者基线特征经过质控后,研究团队纳入了63828例患者和38076例对照的测序数据,共发现1810种突变,其中315种为致病性突变,占17.4%。通过分析14种癌症患者携带BRCA1/BRCA2致病性突变的频率,研究团队发现,男性乳腺癌患者携带BRCA2致病性突变的频率较高(18.9%);卵巢癌患者携带致病性突变的频率次之,其中4.86%存在BRCA1致病性突变,3.42%存在BRCA2致病性突变。此外,还有6种癌症类型患者携带致病性突变的频率超过1%,其中2种携带BRCA1致病性突变,4种携带BRCA2致病性突变。研究团队还分析了患多种类型癌症的患者携带致病性突变的情况,在患一种、两种、三种类型癌症的患者中,BRCA1致病性突变的携带频率分别为为0.44%、0.85%和0.69%,BRCA2致病性突变的携带频率分别为0.97%、1.40%和1.74%。14种癌症类型的患者BRCA1/BRCA2致病性突变携带频率研究团队进一步分析了致病性突变与每种癌症的疾病风险的关系。BRCA1致病性突变与5种癌症的疾病风险增加显著相关,包括卵巢癌(OR=75.6)、女性乳腺癌(OR=16.1)、胆管癌(OR=17.4)、胃癌(OR=5.2)和胰腺癌(OR=12.6);BRCA2致病性突变与7种癌症的发病风险增加有关,包括女性乳腺癌(OR=10.9)、胃癌(OR=4.7)、卵巢癌(OR=11.3)、男性乳腺癌(OR=67.9)、胰腺癌(OR=10.7)、前列腺癌(OR=4.0)和食管癌(OR=5.6)。此外,BRCA1还与淋巴瘤(OR=7.7)和肺癌(OR=3.7)相关,BRCA2与子宫内膜癌(OR=4.0)、宫颈癌(OR=3.2)、肾癌(OR=4.5)和肝癌(OR=2.4)相关。BRCA1/BRCA2致病性突变与14种癌症风险的相关性研究人员分析与BRCA1和/或BRCA2致病性突变显著相关的7种癌症的累积发病风险发现,在乳腺癌中,BRCA1致病性突变携带者到85岁时累积发病风险最高,为72.5%。在卵巢癌、胃癌、胰腺癌和胆管癌中,这一数据分别为65.6%、21.3%、16.0%和11.2%。同时,在乳腺癌中,BRCA2致病性突变携带者到85岁时累积发病风险也最高,为58.3%,其次是前列腺癌(24.5%)。胃癌(19.3%)、卵巢癌(14.8%)、胰腺癌(13.7%)和食管癌(5.2%)累积风险也有所升高。不同癌症中携带BRCA1/BRCA2致病性突变的绝对危险度研究团队还分析了这7种癌症致病性突变携带状态和诊断年龄之间的关系。结果显示,与未携带BRCA1致病性突变的女性患者相比,致病性突变携带者诊断时间提前了5.7年。携带BRCA2致病性突变的女性患者乳腺癌的发病时间提前了5.7年,男性患者前列腺癌的发病时间提前了2.2年。携带BRCA2致病性突变的患者诊断为卵巢癌的时间与未携带者相比延后4.1年。通过分析致病性突变携带者的家族史,研究人员发现,在胆管癌、女性乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌这几种癌症类型中,随着一级或二级亲属报道的癌症类型的增加,携带致病性突变的患者比例增加。7种癌症类型的家族史与患者携带BRCA1或BRCA2致病性突变的关系总之,这项大规模病例对照研究分析了14种癌症类型患者携带BRCA1和BRCA2致病性突变的情况。桃沢幸秀团队发现,BRCA1和/或BRCA2致病性突变除了与已确定的癌症如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌显著相关,与胆管癌、食管癌和胃癌也有较强的关联。另外,BRCA1和/或BRCA2致病性突变与淋巴瘤、肺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肾癌和肝癌这六种癌症也存在相关性。一直以来,BRCA1和BRCA2致病性突变都受到医学界的广泛关注。研究人员基于同源重组修复缺陷机制开发的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制剂,与BRCA1和BRCA2突变之间存在“合成致死”效应,在多种肿瘤中都发挥了显著的治疗效果[10-12]。本研究结果扩大了与BRCA1和BRCA2致病性突变相关的癌症类型范围,明确了有相关癌症家族史的个体进行基因检测的临床意义,同时为这些癌症患者的治疗提供了更多选择。来源:奇点肿瘤探秘
BRCA1/BRCA2突变的致癌能力被低估了

北京大学肿瘤医院团队为中国食管癌患者找到了一线治疗新方案

食管鳞状细胞癌是一种食管鳞状上皮细胞异常增生形成的恶性肿瘤。在组织分型上,亚洲食管癌患者约90%都是食管鳞状细胞癌[1]。我国食管鳞状细胞癌患者数量更是庞大,约占全球食管鳞状细胞癌患者总数的50%[2]。目前,晚期或转移性食管鳞状细胞癌症的一线治疗手段仅限于基于铂的化疗。铂联合紫杉醇是我国常用的治疗手段,还有一些国家首选铂联合5-氟尿嘧啶的给药方案[3, 4]。然而,对于一些晚期或转移性食管癌患者而言,接受铂联合其他化疗药物的双药治疗效果往往不尽如人意,患者中位总生存期小于12个月。因此,寻求更有效的联合治疗策略对于食管鳞状细胞癌患者至关重要。近日,由北京大学肿瘤医院沈琳教授领衔的研究团队,探索了免疫治疗联合化疗对食管鳞状细胞癌症患者的治疗效果,相关研究成果已在国际著名医学期刊British Medical Journal上发表[5]。研究发现,与安慰剂联合化疗相比,免疫检查点抑制剂信迪利单抗联合化疗策略,可显著提高患者的总生存期(OS,12.5个月 vs 16.7个月),将患者的死亡风险降低37%;也提高了患者的疾病无进展生存期(PFS,5.7个月 vs 7.2个月),将患者的疾病进展风险降低44%,为食管鳞状细胞癌患者提供了新的一线治疗方案。论文首页截图免疫细胞上的PD-1与肿瘤细胞上的PD-L1相结合,可抑制T细胞增殖、细胞因子的产生以及细胞毒性功能,使肿瘤细胞逃过免疫系统的清除[6]。靶向PD-1或者PD-L1的免疫检查点抑制剂无疑是癌症治疗领域的“新星”,它们可特异性阻断PD-1/PD-L1通路,减少T细胞的凋亡,逆转肿瘤细胞的免疫逃逸,使免疫系统能够对肿瘤细胞进行有效杀伤。但是,免疫检查点抑制剂单药仅对10-20%的食管鳞状细胞癌症患者有效。PD-1/PD-L1抑制剂联合化疗作为一线治疗手段,已对几种癌症患者显示出有效性[7, 8]。那么,PD-1/PD-L1抑制剂联合化疗策略是否同样对食管鳞状细胞癌有效呢?为了探索PD-1/PD-L1抑制剂联合化疗策略对晚期或转移性食管鳞状细胞癌患者的疗效,2018年12月,中国研究人员开始从全球招募食管鳞状细胞癌患者,进行大范围的随机、双盲、对照和多中心III期临床试验(ORIENT-15研究)。2018年12月14日至2021年4月9日,研究人员从筛选合格的1033名患者中选择659名符合条件的患者,并将他们以1:1的比例随机分组,327人接受信迪利单抗联合化疗治疗方案,332人接受安慰剂联合化疗的治疗方案。此研究涉及中国66个机构和国外13个机构,大部分招募的患者在中国,也有少部分在西方国家。铂联合紫杉醇是我国常用的治疗手段,但是5-氟尿嘧啶是西方治疗食管鳞状细胞癌的首选化疗药物,因此研究人员在试验方案中添加了顺铂/5-氟尿嘧啶的化疗方案。最终试验方案定为:信迪利单抗联合化疗治疗组中,307人接受顺铂/紫杉醇化疗,另外20人接受顺铂/5-氟尿嘧啶化疗;安慰剂化疗组中,309人接受顺铂/紫杉醇化疗,23人接受顺铂/5-氟尿嘧啶化疗。患者每3周接受一次信迪利单抗联合化疗或安慰剂联合化疗,直到患者出现疾病进展、无法忍受的毒性、开始使用新的抗肿瘤治疗方案、撤回同意、失访、死亡、完成最长2年治疗,或经研究人员认定的其他原因而停止。研究的主要终点是OS,次要终点是研究者评估的PFS、客观缓解率(ORR)、缓解持续时间(DOR)、疾病控制率(DCR)及安全特性。试验设计流程图截至2021年4月9日,信迪利单抗联合化疗组的OS中位随访时间是16个月(IQR,12.3-19.4),安慰剂联合化疗组的OS中位随访时间是16.9个月(IQR,11.8-20.2)。OS的期中分析结果显示,信迪利单抗联合化疗组的死亡率是45%,中位OS为16.7个月;而安慰剂联合化疗组的死亡率是61%,中位OS为12.5个月,信迪利单抗联合化疗策略显著延长了患者的OS(HR=0.63,P<0.001)。此外,在PD-L1综合阳性分数(CPS)≥10的患者中,信迪利单抗联合化疗组的中位OS为17.2个月;安慰剂联合化疗组的中位OS为13.6个月,信迪利单抗联合化疗同样显著延长了患者的OS(HR=0.64,P=0.002)。所有患者(上)和PD-L1 CPS≥10患者(下)的OS曲线PFS结果显示,有59%接受信迪利单抗联合化疗组的患者出现疾病进展或死亡,患者的中位PFS为7.2个月;74%接受了安慰剂联合化疗的患者有疾病进展或死亡,患者的中位PFS为5.7个月。与安慰剂联合化疗相比,信迪利单抗联合化疗显著延长了患者的PFS(HR=0.56,P<0.001)。在PD-L1 CPS≥10的患者中,较安慰剂联合化疗组中位PFS(6.4个月)而言,信迪利单抗联合化疗组的中位PFS(8.3个月)同样表现出显著的提升(HR=0.58,P<0.001)。所有患者(上)和PD-L1 CPS≥10患者(下)的PFS曲线接下来,研究人员对患者的ORR进行了统计与分析。信迪利单抗联合化疗组的ORR为66%,而安慰剂联合化疗组为45%,信迪利单抗联合化疗组的ORR显著高于安慰剂联合化疗组(P<0.001)。在PD-L1 CPS≥10的患者中,与安慰剂联合化疗组(ORR=49%)相比,信迪利单抗联合化疗组(ORR=68%)同样显著提升了患者的ORR(P<0.001)。中位DOR结果分析显示,信迪利单抗联合化疗组的DOR为9.7个月,而安慰剂联合化疗组为6.9个月,信迪利单抗联合化疗显著延长了患者的DOR(HR=0.62,P<0.001)。在PD-L1 CPS≥10的患者中,与安慰剂联合化疗组(DOR=5.7个月)相比,信迪利单抗联合化疗组(DOR=12.4个月)同样显著增加了患者的DOR(HR=0.59,P=0.003)。同时,DCR结果表明,信迪利单抗联合化疗组的DCR为90%,而安慰剂联合化疗组为84%。在PD-L1 CPS≥10的患者中,信迪利单抗联合化疗组的DCR为94%,高于安慰剂联合化疗组的85%。以上数据说明,信迪利单抗联合化疗的治疗策略,较单一化疗方法而言可以更好地控制肿瘤的发展。患者的ORR、DOR和DCR情况在治疗安全性方面,信迪利单抗联合化疗组与安慰剂联合化疗组差异性不明显,出现与治疗相关的不良事件率均约为98%。信迪利单抗联合化疗组的3-5级不良事件发生率为60%,安慰剂联合化疗组为55%。总而言之,该项研究发现,与安慰剂联合化疗策略相比,信迪利单抗联合化疗(顺铂/紫杉醇或顺铂/5-氟尿嘧啶)显著提高了晚期或转移性食管鳞状细胞癌患者的OS、PFS和ORR,可更好地控制疾病的发展。该研究为信迪利单抗联合化疗治疗策略的可行性提供了有力的依据,此联合策略有望改善食管鳞状细胞癌患者的治疗效果和生活质量。来源:奇点肿瘤探秘
北京大学肿瘤医院团队为中国食管癌患者找到了一线治疗新方案

GUT:香港中文大学于君团队破解吸烟致肠癌之谜

结直肠癌(CRC)是全球最常见的癌症之一,大量证据表明,饮食、吸烟、肥胖和运动等生活习惯均与CRC的发病密切相关。吸烟不仅会提高肺癌发病风险,也会促使结肠、肾脏和胰腺等器官发生癌变。研究表明,吸烟会显著增加人类结直肠癌的发病率和死亡率,在动物模型中也观察到吸烟会增加结直肠癌发病的风险。那么一个非常直接的问题,吸烟究竟是如何促进CRC发生和发展的呢?这个目前尚不明了。近日,由香港中文大学于君领衔的研究团队,在Gut上发表重要研究成果[1]。她们发现吸烟导致肠道菌群及其代谢物的组成发生改变,导致肠道屏障功能障碍和致瘤、促炎信号通路的激活,从而促进结直肠肿瘤的发生。她们的研究提示,控制肠菌可能是一种预防吸烟人群患结直肠癌的潜在策略。论文首页截图吸烟与CRC的发病率和死亡率密切相关,探索其中的发生机制十分必要。一方面,研究表明,吸烟会增加人肠道中细菌的多样性[2, 3],改变肠道菌群和粘蛋白结构[4];另一方面,现有研究已证实了肠道菌群的改变与结直肠癌的发生存在相关性[5],CRC患者来源的肠道菌群会促进受体小鼠发生结肠癌。但是肠道菌群的改变是否代表着吸烟与结直肠癌的联系,目前并不清楚。为了理清这一关系,于君教授团队将偶氮甲烷(AOM)处理的C57BL/6小鼠每天分别在清洁空气或香烟烟雾中暴露2小时,28周后,利用鸟枪法宏基因组测序和液相色谱-质谱法分析小鼠粪便中微生物和代谢产物的变化。实验造模流程图我们知道腹腔注射AOM会诱导小鼠发生CRC,那么暴露在两种不同空气环境下小鼠的CRC发生情况是否会有不同?研究结果显示,与对照组的小鼠相比,暴露在香烟烟雾中小鼠的结直肠肿瘤数目和大小显著提高;而且免疫组化和蛋白质印迹均显示肠道上皮中Ki67+细胞比例明显增加,这意味着香烟烟雾的暴露促进了小鼠结肠上皮细胞的增殖。香烟烟雾促进了小鼠结肠癌的发生接着,研究人员利用鸟枪法宏基因组测序对两组小鼠的粪便微生物组进行分析,她们发现,经过为期28周的处理后,香烟暴露组小鼠肠道菌群的alpha多样性明显降低,beta多样性聚类存在显著差异。香烟烟雾调节小鼠肠道菌群相对对照组小鼠来说,暴露在香烟烟雾的小鼠中有20种细菌发生了明显改变(p<0.05, FC>1.5),其中Eggerthella. lenta和Staphylococcus capitis显著富集,肠道益生菌Lactobacillus reuteri,Parabacteroides distasonis和Bacteroides dorei减少。此外,她们还发现两组小鼠肠道菌群的关联性发生显著变化,在香烟烟雾暴露组的小鼠中,E. lenta与几种益生菌的丰度呈现负相关,即伴随着E. lenta的富集,几种益生菌的丰度明显降低。除了测序,研究人员还通过液相色谱-质谱法分析了小鼠的粪便代谢物,结果发现两组小鼠的粪便代谢物具有显著差异,有41种代谢物发生了改变(p<0.05),主要富集在胆汁酸代谢通路中,其中牛磺脱氧胆酸(TDCA)的含量在香烟暴露小鼠中明显增高,TDCA是次级胆汁酸中公认的致癌物。那么在香烟暴露组中,发生改变的肠道菌群跟粪便代谢物之间存在哪些关联呢?通过相关性分析,研究人员发现E. lenta与TDCA呈现最强的正相关,而两种减少的益生菌Lactobacillus jensenii,Lactobacillus crispatus与TDCA则呈现负相关。因此,失调的肠道菌群及其代谢物很可能是小鼠发生CRC的重要推手。肠道细菌与差异代谢物的部分Spearman相关性分析接着研究团队研究了香烟烟雾对小鼠肠道屏障功能的影响,她们检测了结肠紧密连接蛋白的表达水平,发现香烟烟雾明显降低了claudin-3和闭锁小带-1(ZO-1)的表达水平;另外,血清中脂多糖(LPS)水平显著提高。这些结果表明香烟烟雾会导致肠道屏障功能受损。香烟烟雾降低了claudin-3和ZO-1的表达为了从分子角度了解吸烟对原癌形成的影响,于君研究团队对小鼠肠道上皮细胞进行基因检测,与未吸烟组相比,香烟暴露组的小鼠肠道上皮细胞有19个基因上调,7个基因下调。富集结果显示,变化基因主要富集在丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路。既往文献报道TDCA可以激活MAPK通路的ERK亚家族,所以研究团队评估了两组小鼠肠道上皮中MAPK/ERK通路的激活情况。ERK1/2是MAPK/ERK通路中关键的调节蛋白,研究人员发现香烟烟雾能够提高ERK1/2的磷酸化水平,且磷酸化的ERK1/2与TDCA呈正相关。以上结果提示香烟烟雾会诱导ERK1/2发生磷酸化,激活MAPK/ERK通路,从而促使结肠癌的发生。随后,为明确炎症相关基因表达的变化,于君团队检测了两组小鼠肠道上皮细胞的炎症和自免相关基因表达情况。结果发现,两组的差异基因主要富集在白介素17(IL-17)和肿瘤坏死因子(TNF)信号通路。qPCR结果验证了香烟暴露组中促炎因子Il17a和Cxcl2转录水平的增加以及抑炎因子Il10的降低。这提示了香烟烟雾促进了结肠中炎症的发生。小鼠肠道上皮细胞的两种芯片检测基因表达结果为了证实香烟烟雾引起的肠道菌群改变对结直肠肿瘤发生的直接作用,她们对无菌小鼠进行了粪便菌群移植,将未吸烟组(GF-AOM)和香烟暴露组(GF-AOMS)小鼠的粪便分别移植到小鼠结肠部位。与之前结果类似,GF-AOMS肠道菌群的alpha多样性明显降低,beta多样性分析显示与GF-AOM小鼠有显著分离;E. lenta仍然是在GF-AOMS中丰度最高的细菌,TDCA含量也显著增高。此外在GF-AOMS中,香烟烟雾组来源的微生物群同样增加了结肠细胞增殖,损害了肠道屏障功能,增强了致癌信号通路MAPK/ERK和促炎基因的表达。因此,肠道菌群的改变有助于香烟烟雾在结直肠癌发生中的促肿瘤作用。机制示意图总的来说,此研究发现吸烟可通过调节肠道菌群组成,诱导肠道菌群失调,促进结肠肿瘤的发生;代谢方面吸烟明显促进TDCA的生物合成,其与肠道中E. lenta细菌呈显著正相关;吸烟会损害肠道屏障,激活致瘤性MAPK/ERK信号通路。本研究首次建立了一种新型的肠道微生物介导的香烟烟雾致结直肠肿瘤发生机制,这提示我们,戒烟至少是通过重建健康的肠道微生物群来预防结直肠癌的可行方法之一。来源:奇点肿瘤探秘 
GUT:香港中文大学于君团队破解吸烟致肠癌之谜

科普图文 || 癌细胞与正常细胞到底有什么区别呢?

1/1、正常细胞只有在接收到机体的“复制命令”(即增殖信号)时才会进行复制。在这些信号消失后,它们就会停下来。1/2、但癌细胞却可以在没有增殖信号的情况下疯狂增殖,就好像它们的增殖开关一直卡在“开启”的位置。2/1、正常细胞在被叫停时会立刻停止增殖,防止细胞之间过度拥挤乃至发生堆积,从而避免破坏组织和身体的美感。2/2、而癌细胞却直接无视“停止”信号,把“不要”和“停下”,曲解成“不要停下”。它们我行我素地继续复制,最终导致细胞相互堆叠、拥挤不堪。3/1、正常细胞在分裂一定次数后就会“逐渐疲倦”,大多数细胞都停止分裂,只有少数细胞继续分裂,总之正常细胞复制分裂的次数是有限的。3/2、但癌细胞可以在分裂复制的道路上,以一种不知疲倦的疯狂一往无前。4/1、当正常细胞“脑子”受伤时,它们会选择自我毁灭(细胞凋亡),完美主义不允许它们苟且偷生。4/2、而癌细胞却不愿意自杀,充分发挥着即使“脑子有病”也要顽强地活下去的乐观主义精神。5/1、血管为组织细胞提供营养物质和氧气,它们经常需要重新铺设和修理维护。这个过程通常是协调而高效的,典型的例子就如伤口愈合和月经周期。5/2、肿瘤也需要血管才能生存,但是肿瘤血管构筑异常,常常扭曲,到处渗漏。这导致了肿瘤的抗药性以及癌细胞的扩散转移。6/1、正常细胞大都老老实实呆在自己的位置上(除了在血液中的细胞及免疫细胞),它们固守本分、从不越雷池一步。而癌细胞却会不甘寂寞地到处溜达、转移扩散(即癌细胞从肿瘤位置转移到身体的远处)。6/2、癌细胞可以利用肿瘤中有缺陷的血管,搭着血流的顺风车转移到离原来的部位很远很远的地方、在多种组织器官中“落地安家”。7/1、当正常细胞的基因(DNA)产生损伤时,它会努力加以修复,结果就是基本所有正常细胞的基因都是一样的。如果损伤过分严重,它们难以修复,它们就会选择 4/1 所描述的完美主义道路,7/2、癌细胞不能很好地修复DNA的损伤,它们的基因组会随着时间的推移而发生巨大的变化。所以,即便同一个肿瘤中的癌细胞有一定的相似,它们的基因却并不是完全一样的——这就叫做肿瘤细胞的异质性,这也是肿瘤细胞产生治疗抵抗的重要原因。参考资料:1.Hanahan, D., & Weinberg, R. (2000). The hallmarks of cancer. Cell, 100(1), 57-70. (Original work published 01/2000AD) [PUBMED]版权声明:本文图片来自网络,仅为科学传播,若有侵权,请联系删除。來源:BioMedAdv
科普图文 || 癌细胞与正常细胞到底有什么区别呢?

《自然·癌症》:发现了能重塑“癌王”肿瘤微环境的联合疗法

胰腺导管腺癌(PDAC)是个疯狂的“杀手”,PDAC患者的10年生存率约为1%[1]。近20年来,靶向治疗和免疫治疗不断取得进步,改写了很多癌症的治疗范式;遗憾的是,经典腺体亚型对目前的临床治疗方案有一定的响应[2,3],而基底样间充质亚型的PDAC对标准化疗和免疫治疗几乎没有反应。PDAC之所如此难治,背后也是有一定的原因的。有研究发现PDAC的肿瘤突变负荷较低,产生的具有免疫原性的新抗原较少,这就使得T细胞难以识别癌细胞;此外,PDAC肿瘤微环境(TME)是免疫抑制性的,使得肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)难以被募集到肿瘤部位[4]。好消息是,最近有研究报道了少量以高水平T细胞浸润为特征的PDAC病例,而且这种特征与患者的总生存期延长有关[5-7]。综合以上研究成果不难发现,将能改善肿瘤微环境的疗法与免疫治疗联合使用,或许是治疗PDAC的有效方式。近期,来自德国海德堡德国癌症研究中心和德国癌症协会转化癌症研究分部的Dieter Saur研究团队,在Nature Cancer杂志上发表了重要研究成果[8]。他们通过系统的高通量筛选发现,MEK抑制剂曲美替尼(trametinib)联合多激酶抑制剂尼达尼布(nintedanib),能够导致癌细胞周期停滞和癌细胞的死亡,还能促进细胞毒性和效应性T细胞的肿瘤内浸润。也就是说,二者联合不仅能杀死癌细胞,还能重编程肿瘤微环境。更重要的是,曲美替尼+尼达尼布还能让难治的间质性PDAC对PD-L1抑制剂敏感。总的来说,这个研究为难治性间质性PDAC开辟了新的治疗途径。众所周知,超过90%的PDAC患者的KRAS发生激活突变。虽然靶向KRAS突变的药物已经用于其他癌症的治疗,但是到目前为止,这些药物还不能有效治疗KRAS突变的PDAC。看来突破口可能得从KRAS促癌通路的下游找。在致癌性KRAS的下游,RAF-MEK-ERK途径在肿瘤的发生中起着核心作用。MEK抑制剂(MEKi)在RAS突变的黑色素瘤和肺癌中已经展现了较好的抗癌效果,遗憾的是,在PDAC患者中,MEKi却失败了。Saur团队前期研究发现,致癌性KRAS基因的突变和不断扩增,推动了PDAC的早期发生和转移。同时,他们还发现具有高度侵袭性的间充质PDAC的KRAS突变体表达水平最高[9]。得知KRAS突变体水平对PDAC表型有强烈的影响后,Saur团队有了新灵感。他们想要开发一种既能够阻止KRAS驱动的肿瘤细胞内在信号转导,又能重编程TME的联合疗法,以提高间充质PDAC治疗效果。为了实现上述目标, Saur团队首先系统地探索了抑制典型的KRAS–RAF–MEK–ERK通路与PDAC治疗获益之间的关系。他们使用MEKi(曲美替尼)处理了一组原代患者来源的PDAC细胞和常规人类PDAC(hPDAC)细胞系。出乎意料的是,经典腺体亚型hPDAC对曲美替尼高度敏感(图1b)。由于临床标本中缺乏代表未分化程度最高、侵袭性最强、具有完整间充质形态的hPDAC细胞,研究人员拓展了筛选范围,他们从表达KrasG12D的小鼠胰腺癌中分离出原代PDAC细胞(mPDAC)并重复上述实验。经检测,相比经典腺体亚型的mPDAC,间充质亚型的mPDAC细胞中的KrasG12D表达最高水平(图1c)。与hPDAC一样,主要是经典腺体亚型mPDAC细胞对曲美替尼敏感,而几乎所有间充质亚型PDAC都对曲美替尼有耐药性(图1d)。随后,Saur团队通过体内外实验证明,使用MEKi或基因敲除手段完全持续性破坏经典KRAS下游信号,都不足以抑制间充质亚型PDAC肿瘤增长。图1:a、G1–G2或G3–G4肿瘤分级的手术切除患者的生存率曲线。b、hPDAC 细胞系中 10 nM 曲美替尼的细胞活力百分比。c、经典和间充质PDAC中等位基因特异性KrasG12DmRNA的表达。d、mPDAC细胞在10 nM曲美替尼的细胞存活率。接下来, Saur团队进行了系统的、高通量的组合化合物筛选,以确定与曲美替尼具有协同作用的药物。他们用曲美替尼分别联合418种药物,在代表经典腺体亚型和KRAS突变的间充质亚型的人和小鼠的PDAC中进行筛选。经过大量的细胞实验发现,曲美替尼与尼达尼布(T/N)在人和小鼠间充质亚型的PDAC治疗中具有显著的协同作用。尼达尼布是临床批准的RTK抑制剂,是治疗间充质PDAC的最热门药物之一。为了找到曲美替尼和尼达尼布的直接靶点,研究人员进一步研究了经典腺体亚型及间充质亚型的6种mPDAC,结果发现曲美替尼能选择性抑制MEK1/2,而尼达尼布的作用靶点广泛,主要富集在RTK和细胞表面受体中。随后,为了确定介导T/N应答相关通路,Saur团队分析了磷酸蛋白质组的变化。在间充质亚型的PDAC中,一系列重要的癌症相关通路的活性降低,如调节PI3K/AKT信号的细胞周期调节因子细胞周期蛋白依赖激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白E、PP2A和IER3、ERBB2、mTOR和KIT下游信号等,以及RAF依赖和非依赖性ERK1/2激活。这些结果表明间充质亚型的PDAC依赖广泛的RTK驱动的信号输入。上述发现提示了需要以多种激酶为靶点,才能在KRAS突变的间充质亚型PDAC中实现有效的治疗!为了进一步破译T/N协同作用的关键基因,Saur团队在三种间充质亚型的小鼠PDAC细胞中使用了全基因组混合筛选,以及基于CRISPR基因编辑技术筛选。发现在前期实验中确定的53个尼达尼布靶点中,15个与曲美替尼有功能相关性。此外,他们还通过CRISPR基因编辑技术,发现多个靶点的组合缺失导致间充质亚型的PDAC对曲美替尼敏感,其中Prkaa1、FGFR1和Map2k5的联合缺失作用最为显著。这再一次证实需要广泛的靶点来有效和全面地治疗KRAS突变的间充质PDAC。令人兴奋的体外实验结果,驱使研究人员构建经典腺体亚型和间充质亚型的小鼠PDAC原位移植模型,以探索体内联合治疗疗效。实验结果发现T/N联合疗法有效抑制间充质亚型的PDAC肿瘤增长,肿瘤体积显著减少约40%,且小鼠存活率延长一倍(图2b-d)。图 2 a Kaplan–Meier曲线比较经典和间充质原位PDAC模型的存活率。b MRI评估1周治疗后经典腺体亚型和间充质型PDAC肿瘤体积变化。c 对照组和T/N治疗组小鼠的代表性MRI。d 经典和间充质原位模型的Kaplan–Meier生存曲线。令人欣喜的是,这是第一种对KRAS突变体基因扩增驱动的间充质PDAC有效的联合疗法!至于背后的机制,Saur团队发现T/N治疗显著增加了T细胞向间充质PDAC的浸润,将“冷肿瘤”PDAC转化为具有免疫响应的“热肿瘤”。同时,他们还发现一个有趣的现象。间充质PDAC的肿瘤切片显示CD8+T细胞浸润增加在血管周围最为明显,他们认为这可能是因为T/N联合治疗重塑了血管导致的。相比之下,经典腺体亚型的PDAC肿瘤却表现出免疫排斥的特征,仅在肿瘤边缘有中度富集的T细胞(图3a-d)。表明T/N联合治疗仅能重编程间充质亚型的PDAC,而对经典亚型的作用并不明显。图 3 a T/N治疗小鼠肿瘤中适应性免疫细胞群的比例。b T/N联合治疗1周的肿瘤CD4+和CD8+T细胞的流式统计分析。c T/N治疗1周的原位移植间充质模型的肿瘤切片的CD3+和CD8+T细胞的IHC染色的代表性图像。d CD3+细胞染色组织切片的代表性图像(绿色)。随后,为了研究T细胞在治疗反应中的作用,Saur团队构建了T细胞缺失的小鼠模型,发现T细胞的缺失减弱了T/N的治疗效果,间充质PDAC小鼠的生存期也降低了,但与对照组相比,还是一定程度的延长了荷瘤小鼠的生存时间(图4)。表明T/N起效并非仅由T细胞介导,可能还与TME重编程和药物对肿瘤细胞直接作用有关。图 4 CD3敲除和C57BL/6WT小鼠原位移植经典(上)和间充质(下)PDAC的Kaplan-Meier存活曲线基于上述重大发现,既然T/N能够促进间充质PDAC癌细胞死亡及重塑其微环境,招募细胞毒T细胞浸润肿瘤部位,那么是否意味着也能使间充质PDAC对ICB治疗敏感?带着上面的问题,Saur团队将T/N联合PD-L1抑制剂在小鼠间充质PDAC模型上进行了验证。实验结果表明,T/N联合PD-L1抑制剂治疗可使肿瘤抑制率高达约80%,并提高间充质PDAC小鼠的存活率,其中位生存期比T/N治疗组延长10.5天,与对照组相比延长30.5天。相比之下,在T/N的基础上联合PD-L1抑制剂对经典腺体亚型PDAC的影响不大。此外,两种亚型对单独使用PD-L1抑制剂均无应答(图5a、c)。图 5 a瀑布图显示治疗1周后,经典腺体亚型和间充质型PDAC对T/N联合PD-L1抑制剂治疗的肿瘤大小变化。c 经典腺体亚型和间充质型PDAC对T/N联合PD-L1抑制剂治疗的Kaplan–Meier生存曲线。最后,为了全面、客观地研究T/N治疗诱导的TME改变,并从机制上破译药物对经典腺体亚型和间质亚型的PDAC肿瘤微环境的作用,Saur团队还对肿瘤组织进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。他们发现,T/N治疗的间充质PDAC中具有未成熟T细胞基因表达特征的CD4+和CD8+T细胞显著减少,而具有功能性细胞毒性、效应和记忆基因表达特征的成熟T细胞显著增加(图6b-c)。在T/N的基础上加入PD-L1抑制剂后,细胞毒性T细胞和效应T细胞进一步增加,几乎占所有T细胞的75%(图6b)。此外,在间充质PDAC中,T/N组合特异性地诱导CXCL12、CXCL16和TNFSF12的分泌,而CCL2、CSF1和LGALS9的表达下调。图 6 a 左:UMAP图显示了CD3g、CD4和CD8a标记基因在经典性和间充质PDAC中通过scRNA-seq鉴定的整个T细胞群体中的表达。中图:所有治疗组和对照组的经典PDAC的T细胞(黄色)和间质PDAC的T细胞(蓝色)的UMAP图谱。右图:UMAP图显示了scRNA-seq鉴定的6个T细胞亚群。b 按治疗条件和PDAC亚型划分的细胞比例,通过对a中注释的T细胞簇的scRNA-seq分析。c经典和间充质PDAC的选定T细胞簇中选定基因的表达热图。综上所述,T/N治疗能够激活间充质PDAC的TME,从而有利于ICB治疗。总的来说,Dieter Saur团队的研究,通过单细胞RNA测序、CRISPR筛选和免疫表型分析等方法,发现曲美替尼和尼达尼布联合疗法能够重塑间充质PDAC的肿瘤微环境,促进细胞毒性T细胞和效应T细胞在肿瘤内的浸润,从而使间充质PDAC对PD-L1抑制剂敏感。本研究结果为治疗高度侵袭性和难治性KRAS突变的间充质PDAC开辟了新的思路和途径,这种联合疗法或能应用于其他对免疫治疗响应差的难治性肿瘤中。除此之外,还提示我们,在体外筛选到临床实践的药物研发中,应考虑对TME进行重塑以增强抗肿瘤作用。来源:奇点肿瘤探秘  奇点糕
《自然·癌症》:发现了能重塑“癌王”肿瘤微环境的联合疗法

Nat Commun:科学家发现阿尔茨海默病的潜在治疗靶点!

阿尔茨海默病以家族性和散发性形式出现。家族性 AD 由改变淀粉样蛋白前体蛋白加工的常染色体显性突变引起。相反,虽然没有单一的散发性 AD 病因,但其发病率因与脂质代谢、免疫和突触功能相关的基因变异而增加。尽管具有独特的遗传基础,但家族和散发形式会出现类似的认知缺陷和几乎无法区分的神经病理学,包括淀粉样蛋白、tau、脂质、免疫和突触的异常。这些病理与其各自在AD发展中的作用之间的确切联系尚不清楚。其中,脂质异常是这些病理中调查和了解最少的。前期研究表明,SCD抑制剂(SCDi)输注到症状前AD小鼠的心室中减少了富含MUFA的甘油三酯的积累,并挽救了脑室周围和海马神经干细胞活性的早期下降。由于海马体是AD功能障碍的关键位点,那么SCDi是否可以改善海马功能呢?近日,舍布鲁克大学的研究学者在Nat Commun上发表了一篇题为“Stearoyl-CoA Desaturase inhibition reverses immune, synaptic and cognitive impairments in an Alzheimer’s disease mouse model”的研究性论文,研究了硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)在AD发病机制中的作用,SCD是脂肪酸去饱和度的关键调节剂。AD14 的 3xTg 小鼠模型携带人类 APPSwe、tauP301L 和 PS1M146V 突变,早在6个月大时,在明显的淀粉样斑块和神经原纤维缠结发作之前,就会出现学习和记忆障碍症状。在本研究中,为了更好地了解早期有症状的3xTg海马体的遗传状态,他们对8个月大的雌性野生小鼠和3xTg小鼠进行了全海马RNA测序。结果表明,家族性AD的3xTg模型发展了脂质,免疫和突触基因的变化,这些生物学类别与散发性AD的发病机制有关;脂质代谢基因的转录组学变化是3xTg海马体的突出特征;MUFA代谢缺陷可能特别相关。鉴于脂肪酸代谢基因(包括SCD)在症状阶段在海马体中明显失调,研究人员猜测SCD活性可有助于观察到的转录组学紊乱。经研究发现,脑室内施用SCDi1个月会深刻影响3xTg海马基因表达谱。SCD抑制在WT和3xTg小鼠之间恢复了超过40%的DEG。GO富集分析表明,SCD抑制可能正在影响与神经系统发育和突触相关的生物过程。此外,研究发现,SCD 抑制可逆转空间学习和记忆中的 3xTg 缺陷,而焦虑、神经干/祖细胞增殖、淀粉样蛋白负荷、tau高磷酸化和神经元损失保持不变。在3xTg小鼠中施用SCDi对海马突触相关基因表达产生广泛影响,并导致海马树突棘,树突状结构和活性相关IEG表达的恢复。通过单细胞分析,确定MHC-I基因是3xTg海马小胶质细胞中SCDi的主要靶标,此外,SCDi改变3xTg海马体中小胶质细胞的细胞景观。图 SCDi输注有效调节3xTg海马体中的基因表达,对免疫和突触相关基因有主要影响总之,该项研究表明,脑脂肪酸代谢将AD基因与下游免疫,突触和功能障碍联系起来,将SCD确定为AD治疗的潜在靶标。来源:生物谷
Nat Commun:科学家发现阿尔茨海默病的潜在治疗靶点!

首次发现CD4+T细胞可以抑制癌细胞周期,直接发挥抗肿瘤作用

众所周知,T细胞是抗肿瘤的主力军之一。目前主流的肿瘤免疫疗法包括免疫检查点抑制剂、CAR-T细胞等,基于此,我们对CD8+T细胞在抗癌中的贡献已经有了很好的认知[1-3],但是我们对CD4+T细胞除了辅助作用之外的功能了解得还不是很充分。近日,由赛诺菲和Mode X Therapeutics研发部门的Lily Pao博士、Zhi-yong Yang博士、Gary J. Nabel博士领衔的研究团队,在《自然》上发表重要研究成果[4]。他们发现靶向HER2和T细胞的HER2/CD3×CD28三特异性抗体,不仅能够促进CD8+T细胞对乳腺癌细胞的杀伤,还能够以CD4+T细胞依赖的方式直接抑制肿瘤细胞的分裂,从而达到抑制肿瘤生长的效果。他们的研究成果提示CD4+T在辅助作用之外还具备直接的抗肿瘤功能。论文首页截图多特异性抗体是新兴的肿瘤免疫治疗药物,通过人工设计使Y型抗体的双臂分别靶向不同的抗原,从而使一个抗体能够结合单个细胞或多个细胞上的不同抗原。多特异性抗体依靠阻断免疫抑制性受体,或将免疫细胞拉近肿瘤细胞并激活免疫细胞等机制发挥抗肿瘤作用[5]。本研究构建的三特异性抗体HER2是人类表皮生长因子受体酪氨酸激酶家族的成员,在一些乳腺癌、胃癌的肿瘤细胞中高表达,这使得我们可以使用靶向HER2的单克隆抗体对患者进行治疗[6,7];而在三阴性乳腺癌中,HER2的表达显著下调,对靶向HER2的单抗疗法产生耐药性[8]。因此,我们需要更加有效的治疗手段克服HER2低表达肿瘤对靶向HER2疗法的耐药性。Nabel团队想借助多特异性抗体的力量,将T细胞引导至HER2+肿瘤细胞身旁,并将T细胞激活,促进它对肿瘤细胞的杀伤。考虑到T细胞均表达CD3和CD28分子,他们构建了HER2/CD3×CD28三特异性抗体。在体外测试中发现该抗体可以刺激T细胞产生IL-2、激活NF-κB通路,并能够介导T细胞以抗原特异性的方式杀伤HER2+肿瘤细胞。同时,他们注意到该抗体介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力与肿瘤细胞上HER2的表达水平呈正相关。三特异性抗体在体外激活T细胞,诱导T细胞杀伤HER2阳性肿瘤细胞为了研究这个三特异性抗体在体内的治疗效果,Nabel团队给荷瘤的重度免疫缺陷小鼠转输人原代T细胞,随后给予三特异性抗体治疗。结果显示,不论是HER2高表达肿瘤,还是HER2低表达肿瘤,在使用抗体治疗后肿瘤的生长都被有效抑制。这些数据提示该抗体具有治疗HER2低表达肿瘤的潜力。那么在治疗过程中到底是哪一群细胞发挥了主要作用呢?Nabel团队分别向荷瘤小鼠转输了人CD3+混合T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞,并使用三特异性抗体治疗。最终发现,接受三特异性抗体治疗后,转输CD3+混合T细胞和CD4+T细胞的小鼠肿瘤几乎完全消失,而仅转输了CD8+T细胞的小鼠肿瘤几乎没有得到抑制。这可能是由于在该实验体系中CD8+T细胞缺少Th细胞的辅助,存活率下降。三特异性抗体在人源化小鼠模型中展现治疗效果到这里Nabel团队注意到一个有趣的现象,仅有CD4+T存在的情况下,肿瘤的生长完全被抑制了!为了进一步探究背后的原因,Nabel团队将CD4+T细胞与HER2+肿瘤细胞共培养24小时。结果显示,在有三特异性抗体存在的情况下,CD4+T细胞十分有效地抑制了肿瘤细胞的分裂,使肿瘤细胞的细胞周期停滞在G1/S期。而CD8+T细胞则不具备抑制细胞周期的能力。这些数据表明CD4+T细胞可以通过使肿瘤细胞的细胞周期停滞的方式抑制肿瘤生长。同时也说明,三特异性抗体可以通过不同但是互补的机制,刺激CD4+T和CD8+T细胞抑制肿瘤生长。在有三特异性抗体的情况下,CD4+T细胞使肿瘤细胞的细胞周期停滞在G1/S期那三特异性抗体为什么能使肿瘤细胞的细胞周期会陷入停滞呢?Nabel团队对和T细胞共孵育24小时的肿瘤细胞进行了RNA测序。数据分析结果显示,在三特异性抗体存在的情况下,与CD4+T细胞共孵育的肿瘤细胞中,与细胞周期和细胞分裂有关的基因表达显著下调,而促炎反应——TNF-α和IFN-γ途径——的基因显著上调。这与CD4+T细胞抑制肿瘤细胞分裂的现象一致。既然使用抗体刺激CD4+T细胞会促使其分泌大量IFN-γ和TNF-α,那么到底是那种细胞因子介导了对肿瘤细胞分裂的抑制呢?通过体外阻断实验,Nabel团队发现,当使用抗体中和TNF-α后,CD4+T细胞抑制肿瘤细胞生长的能力就被极大地削弱了(但是CD8+T细胞则不会被削弱)。这说明CD4+T细胞是通过分泌TNF-α来抑制肿瘤细胞的细胞周期。CD4+T细胞通过分泌TNF-α抑制肿瘤细胞生长总的来说,这项研究不仅构建了一种能够诱导T细胞攻击HER2低表达肿瘤细胞的三特异性抗体,还首次发现CD4+T细胞可以通过直接抑制肿瘤细胞的细胞周期发挥抗肿瘤作用,这是一种先前没有认识到的抗肿瘤免疫机制。同时也提示后续的研究应该对CD4+T细胞的作用加以关注,这将有助于我们开发出同时提高CD4+T和CD8+T细胞抗肿瘤活性的药物,达到更好的治疗效果。来源:奇点肿瘤探秘  奇点糕
首次发现CD4+T细胞可以抑制癌细胞周期,直接发挥抗肿瘤作用

《细胞》:能转移到大脑的癌细胞,究竟有啥特点?

脑转移瘤(BrM)指原发于身体其他部位的肿瘤细胞转移至颅内,造成肿瘤在颅内生长的一种疾病,以肺癌脑转移最为常见,其次为乳腺癌和黑色素瘤。据统计,癌症患者发生脑转移的概率高达20%-40%[1],即使进行了积极的综合治疗,脑转移瘤患者2年和5年的中位生存率也仅为8.1%和2.4%[2]。遗憾的是,目前医学界对于肿瘤细胞转移到脑中并定植的分子机制知之甚少,也缺乏关于脑转移瘤内细胞组成及功能状态的详细信息,这些都阻碍着研究人员对脑转移瘤进行深入研究。近期,来自加州大学旧金山分校的Hugo Gonzalez教授团队通过对脑转移瘤组织进行单细胞测序(scRNA-seq),并结合质谱流式(CyTOF)等技术,揭示了脑转移瘤细胞以增殖和炎症作为主要的两种细胞状态,并对基质中的免疫细胞与细胞微环境的关系进行了总结和剖析,有助于对脑转移瘤细胞特性及其与细胞微环境交互的理解,相关成果发表于《细胞》杂志[3]。▲论文首页截图研究人员收集了原发肿瘤为黑色素瘤(n=3)、乳腺癌(n=3)、肺癌(n=3)、卵巢癌(n=2)、结直肠癌(n=1)、肾癌(n=1)、成人横纹肌肉瘤(n=1)以及不明原发癌(n=1)等15例患者的脑转移瘤标本,对其进行单细胞测序,并对其中11个样本基于免疫表型进行质谱流式分析。最后总共捕获了80377个单细胞转录本,通过评估标记物表达、染色体畸变、拷贝数变异等对细胞进行注释,将其标记为49488个脑转移瘤细胞(MTC)及30889个脑转移瘤相关非恶性基质细胞。有趣的是,来自不同患者的肿瘤基质细胞在降维图(UMAP)中形成了多个聚集性的簇,而每个患者的脑转移瘤细胞则形成了独立的簇,且每个病例之间均没有重叠,这提示了脑转移瘤细胞具有高度患者间异质性(图1)。▲图1 对15位患者的脑转移瘤组织进行scRNA-seq和CyTOF,通过UMAP降维,并对细胞进行注释研究人员首先分析了肿瘤中的基质细胞,发现其主要由血管细胞(内皮细胞和壁细胞)、炎性免疫细胞和间充质祖细胞组成,并根据标记基因的表达确定了20个不同的簇(图2)。▲图2肿瘤中的基质细胞:具有标记基因CLDN5和PECAM1的内皮细胞(EC-1,EC-2和EC-3簇)、具有标记基因RGS5和ACTA2的壁细胞(PC)和血管平滑肌细胞(vSMCs,PC-1,PC-2,PC-3簇)、具有标记基因ISLR和CTHRC1的间充质基质细胞样细胞(MSC-like-1和MSC-like-2)、具有标记基因CD3D和IL7R的 T细胞(T:CD8+:EM,T:CD4+:CM1,T:CD4+:cm2,Tregs和T:Cm)、具有标记基因JCHAIN和MZB1的B细胞(B-c1和B-c2)、具有标记基因AIF1和LYZ的转移相关巨噬细胞(MAMs:APOE+和MAMs:S100A8+)、具有标记基因CD1C和CLEC10A的树突状细胞(DC,cDC2:CD1C+/CLEC10A+)及具有标记基因GFAP和S100B的星形胶质细胞基质中的血管细胞构成了血-肿瘤界面(BTI),与脑转移瘤患者的化疗抵抗息息相关。根据scRNA-seq结果,血管内皮细胞主要分为了三个簇(EC-1、EC-2和EC-3),其中EC-3为动脉样内皮细胞(标志基因为EFNB2和GJA5),EC-2为静脉样内皮细胞(标志基因为ACKR1和NR2F2),EC-1则介于两者之间。EC-1簇细胞表达与血管生成和胶原沉积等过程相关的基因,EC-2簇则表达与缺氧、炎症和抗原呈递相关的基因。此外,研究人员还在内皮细胞中检测到6个多特异性ATP结合盒(ABC),包括ABCB1(即多药耐药蛋白1,MDR)和ABCG2,这两种转运蛋白都是正常血脑屏障中的关键分子,在静脉样(EC-2簇)内皮细胞汇聚的区域明显高表达(图3)。▲图3 在内皮细胞中检测到6个多特异性ATP结合盒(ABC),ABCB1和ABCG2在静脉样(EC-2簇,红色)内皮细胞汇聚的区域明显高表达接着研究人员分析了脑转移瘤中浸润免疫细胞的特征,发现脑转移瘤中的免疫细胞以T细胞和巨噬细胞为主,其中T细胞展现出了更高的异质性,主要由5个簇组成:CD8+效应记忆T细胞(T:CD8+:EM簇,表示CD8+ effector memory T cells,下文以此类推)、中央记忆T细胞(T:CD4+:CM1簇、T:CD4+:CM2簇和T:CM簇)和调节性T细胞(Tregs簇)。这些细胞具有不同的免疫状态与功能,如T:CD8+:EM簇富含细胞毒性分子(如GZMA和IFNG),T:CD4+:CM簇则代表一种高表达LTB、IL32等免疫调节标记物的激活状态,而表达低水平CD4和CD8A的T:CM簇虽然也表达LTB和IL32,但其还富集干扰素相关基因(如ISG15和MX1)。为了更好地理解这些T细胞状态及功能转变,研究人员使用了一种非线性降维技术,用以捕捉高维数据中的几何结构和功能状态[4]。这一分析表明,这5个T细胞簇按扩散成分1(DC1)分数有序排列。在与DC1呈正相关的前50个基因中,有与淋巴细胞活化相关的分子(如CORO1A和LCK)、与趋化和迁移相关的分子(如CCR7和CXCR4),且这前50个DC1相关基因的表达与T细胞激活基因簇(GO:0042110)之间有很强的相关性,表明T细胞激活状态的不同驱动了T细胞的多样性。(图4)▲图4 5个T细胞簇按扩散成分1(DC1)分数有序排列,且前50个DC1相关基因的表达与T细胞激活基因簇(GO:0042110)之间有很强的相关性为了了解每种T细胞状态与细胞微环境相关作用,研究人员评估了调控微环境和代谢相关基因的表达,结果发现干扰素信号相关基因在T:Cm簇中占主导地位,与T细胞高激活相关的耗竭特征富集在T:CD8+:EM和T:CD4+:CM簇中,而那些DC1评分较低的T细胞簇(T:CD4+:cm2,Treg和T:Cm)则表现出强烈的无功能特征。此外,从激活的T细胞到无功能的T细胞的这种表型转变,与细胞代谢从糖酵解和三羧酸循环为主向脂质代谢为主的转变相吻合,以上结果揭示了T细胞功能状态(从激活/耗竭到无功能),与伴随的代谢和微环境重编程相关。最后,研究人员还研究了脑转移瘤中的主体——肿瘤细胞,通过非负矩阵分解(NMFS)的方法[5],识别出了两类潜在的肿瘤细胞亚群,且在外部数据集和动物脑转移模型中发现了同样的现象:一群高表达增殖和pre-mRNA剪接相关基因,另一群高表达是应激、炎症、翻译和细胞外基质沉积相关基因。产生这两类细胞群体很可能与细胞外基质相关。该研究也存在一定局限性,由于缺乏匹配的颅外原发肿瘤的数据,导致无法研究脑转移瘤与原发肿瘤之间的差异与联系。总的来说,这个研究全面分析了脑转移瘤中细胞类型和细胞功能状态,通过对脑转移瘤细胞、免疫细胞和其他基质细胞的单细胞分辨率分析,加深了对肿瘤细胞固有特性和细胞微环境特性在肿瘤脑转移中的相互作用的理解,有助于将来针对脑转移瘤的疗法的开发。来源:奇点肿瘤探秘 奇点糕
《细胞》:能转移到大脑的癌细胞,究竟有啥特点?

CD:新型细胞内免疫检查点诞生,抗癌效果或超PD-1抑制剂

近年来,随着对免疫调节机制的深入研究,免疫检查点抑制剂的应用使肿瘤治疗从传统的放疗、化疗向精准靶向治疗发展,开启了实体肿瘤治疗的新时代。免疫检查点抑制剂是目前最常见的免疫治疗方案,在黑色素瘤、肺癌等肿瘤的治疗中展现出显著成效[1,2]。例如PD-1抑制剂、CTLA-4抑制剂等,均靶向T细胞表面免疫抑制分子,从而提高T细胞介导的抗肿瘤能力,抑制肿瘤进展。由于肿瘤异质性和肿瘤微环境的复杂性,免疫检查点抑制剂总体治疗有效率较低[3],发现新的免疫检查点分子或协同免疫治疗的靶点也是近几年的研究热点。而目前对免疫检查点的研究多限制于细胞表面,细胞内是否存在类似的检查点分子仍知之甚少。将目光向“内”聚焦,或许会给免疫治疗研究带来新的灵感。近日,来自澳大利亚莫纳什大学的Tony Tiganis及其研究团队在Cancer Discovery发表了一项研究成果。他们在肿瘤浸润T细胞的内质网上发现一个新的胞内免疫检查点——酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)。PTP1B的高表达,会抑制T细胞的增殖和杀伤力,进而促进肿瘤的生长;如果敲除PTP1B,会促进T细胞STAT5信号通路的活化,进而增强T细胞增殖能力和杀伤力,抑制肿瘤生长。值得一提的是,使用药物抑制PTP1B的活性,不仅可以通过T细胞抑制肿瘤的生长,还能增强PD-1抑制剂的治疗效果。此外,抑制PTP1B的活性也能增强CAR-T细胞对实体瘤的浸润和抗肿瘤能力。基于以上研究成果,Tiganis团队认为PTP1B是一种新的细胞内免疫检查点分子和肿瘤治疗靶点,它的靶向药物具有很大的临床应用价值,可联合PD-1抑制剂、辅助CAR-T细胞实现更好的抗肿瘤效果[4]。论文首页截图蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)家族是一类细胞内磷酸酶,可与蛋白酪氨酸激酶(PTK)共同调节多种细胞内信号转导。有报道PTP家族的SHP-1(PTPN6编码)和SHP-2(PTPN11编码)可调控T细胞表面PD-1下游信号的磷酸化和信号传递[5,6];TCPTP编码基因PTPN2的单核苷酸多态性(SNP)位点突变与自身免疫性疾病发生相关,敲除该基因后可增强T细胞抗肿瘤能力[7,8]。预示着PTP家族蛋白与免疫功能调节之间存在密切联系。PTP1B(编码基因PTPN1)是一种内质网定位的磷酸酶,在结构和序列上与TCPTP高度同源,二者在协调中枢神经系统对能量代谢和葡萄糖稳态的调节等多种生理、病理过程中,协同发挥作用[9,10],因此是治疗代谢性疾病的重要靶点。有研究发现,全身敲除PTP1B以及其靶向药物trodusquemine(MSI-1436)能抑制小鼠乳腺癌生长及转移[11]。但PTP1B在T细胞中的功能仍然未知。Tiganis团队为探究PTP1B能否作为一种细胞内免疫检查点分子发挥作用,进行了以下实验。他们将AT3-OVA细胞(表达OVA抗原肽的鼠源乳腺癌细胞系)接种至Ptpn1+/+、Ptpn1+/−及Ptpn1−/−的小鼠腹股沟乳腺脂肪垫中,发现PTP1B缺失可显著抑制肿瘤生长,增加肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)数量,意味着PTP1B缺失可以提高荷瘤小鼠生存率,增强免疫治疗效果。他们还通过嵌合体小鼠骨髓重构实验发现,仅免疫细胞缺失PTP1B就足以抑制肿瘤细胞生长,增加实体瘤中的淋巴细胞浸润数量。这暗示PTP1B对T细胞的功能有重要的调节作用。PTP1B缺失可抑制乳腺癌生长,增加TIL数量考虑到杀伤性CD8+T细胞(CTL)在抗肿瘤中的重要性,Tiganis团队探究了PTP1B在肿瘤浸润CD8+T细胞中的表达和功能。他们发现,在脾脏中,相比于未活化状态,效应和记忆CD8+T细胞的PTP1B表达有轻微上调,但处于肿瘤微环境中的CD8+T细胞PTP1B的表达量显著提高。他们分析公开数据库中人黑色素瘤的单细胞测序结果发现,相比于干性或记忆T细胞(TCF7高表达),PTP1B的表达水平在肿瘤浸润CD8+T细胞的效应(interferon γ、granzyme B、perforin)或耗竭(TIM3、LAG3、PD-1)亚群中更高,也说明PTP1B高表达预示着PD-1抑制剂治疗效果不佳[12]。PTP1B在肿瘤浸润CD8+T细胞中高表达同时,Tiganis团队构建了T细胞特异性敲除Ptpn1的小鼠(Lck-Cre;Ptpn1fl/fl或Lck-Cre;Ptpn1fl/+),发现PTP1B缺失可增强T细胞介导的抗肿瘤免疫功能,增加肿瘤内效应或记忆T细胞数量。随后,在接种了AT3-OVA的荷瘤小鼠体内过继转移未活化状态的抗原特异性T细胞后,也观察到PTP1B缺失增强了抗原特异性T细胞的增殖能力和效应分子表达水平,促进了TIL向瘤内浸润,进而抑制肿瘤生长。T细胞特异性敲除PTP1B可增强T细胞效应功能,抑制肿瘤生长结合PTP1B可被肿瘤微环境显著上调表达,及其对T细胞抗肿瘤能力的抑制,不难发现PTP1B有成为细胞内免疫检查点的潜能。那么PTP1B如何介导T细胞的抗肿瘤功能呢?我们都知道,T细胞活化需要第一信号(TCR信号)和第二信号(共刺激分子信号,如CD28)共同作用,除此以外,第三信号(细胞因子受体信号,如CD25)对T细胞活化和增殖也十分重要[13,14]。Tiganis团队检测了TCR信号下游经典的蛋白磷酸化信号,发现PTP1B缺失并不影响TCR信号的传递,但促进了与T细胞活化相关的表面分子的表达,如CD44、CD69、CD25(IL2受体)。同时也检测到,在PTP1B缺失T细胞中,STAT5磷酸化信号有显著增加,下游靶基因Eomes和T-bet表达水平增加,抗凋亡分子BCL2转录增加。T细胞特异性敲除PTP1B促进了T细胞活化和STAT5磷酸化信号传递Tiganis团队还发现,在PTP1B缺失的条件下,如果再敲除Stat5,就能将T细胞活化水平和抗肿瘤能力恢复至野生型水平。这说明PTP1B对T细胞功能的抑制依赖于STAT5的信号传递。鉴于PTP1B的靶向药物trodusquemine(MSI-1436)已被证实在人体内有良好的安全性和耐受性,因此,Tiganis团队给不同类型的荷瘤小鼠使用MSI-1436,结果均观察到良好的抗肿瘤效果。MSI-1436对不同类型肿瘤均有抑制效果为了了解PTP1B抑制剂与PD-1抑制剂是否有协同作用,Tiganis团队将二者联合使用,结果发现MSI-1436的治疗效果优于PD-1抑制剂,而且MSI-1436联合PD-1抑制剂的抗肿瘤效果优于二者单独使用。这说明这两个药物之间存在协同作用。MSI-1436促进PD-1单抗治疗效果值得一提的是,Tiganis团队还发现,PTP1B缺失或抑制也能促进CAR-T细胞的效应功能和向实体瘤的浸润,增强CAR-T细胞对实体瘤的抑制能力。总而言之,此项研究为肿瘤免疫治疗寻找到一个新的细胞内免疫检查点,证明靶向PTP1B可以提高CTL的杀伤功能,促进T细胞向效应或记忆表型分化,增加TIL数量。让人眼前一亮的是,小鼠实验表明,PTP1B抑制剂的效果优于PD-1抑制剂,而且PTP1B抑制剂联合PD-1抑制剂还能发挥1+1>2的效果。在未来,PTP1B抑制剂与PD-1抑制剂联合使用,或许能解决PD-1抑制剂的耐药性问题,将免疫细胞浸润少的“冷肿瘤”转化为炎症型的“热肿瘤”从而更好的响应免疫治疗。此外,PTP1B这个细胞内的免疫检查点,也有可能成为CAR-T治疗实体瘤的突破口。来源:奇点肿瘤探秘  奇点糕
CD:新型细胞内免疫检查点诞生,抗癌效果或超PD-1抑制剂

JITC:香港中文大学于君团队发现胃癌免疫治疗新靶点

胃癌的发病率和死亡率在全球范围内均位居前列,我国是胃癌大国,占全球胃癌新发病例的43.9%及死亡病例的48.6%[1]。在过去的几十年里,胃癌的治疗取得了长足的进步,但是死亡率仍然很高。因此探索胃癌发生的分子机制,寻找有效的治疗靶点是改善预后的关键。N6-腺苷酸甲基化(m6A)是常见的RNA转录后修饰,主要用于维持mRNA的稳定性。发生m6A修饰的mRNA想要行使特定的生物学功能,需要甲基化阅读蛋白。含YTH结构域的家族蛋白1(YTHDF1)是一种重要的m6A阅读蛋白。最近的研究表明,YTHDF1可以通过卷曲蛋白7(FZD7)和泛素特异性肽酶14(USP14)促进胃癌的发生[2]。那么,YTHDF1在胃肿瘤微环境中的起着怎样的作用呢?近日,来自香港中文大学的于君教授及其团队在《癌症免疫治疗杂志》上发表重要研究成果,他们发现,YTHDF1在胃癌中过表达,并通过诱导肿瘤细胞增殖和抑制树突状细胞介导的抗肿瘤免疫反应来促进胃癌的进展。此外,YTHDF1缺失可促进肿瘤细胞中干扰素受体1(IFNGR1)和JAK-STAT1信号通路的过表达,进而增加抗肿瘤免疫的敏感性。未来,YTHDF1有望成为胃癌免疫治疗的新靶点[3]。论文首页截图接下来我们一起看看这项研究是如何开展的。首先,研究人员收集了2015年到2018年在威尔士亲王医院确诊的胃癌患者组织样本101例组成队列1,用于检测YTHDF1 mRNA的表达情况,同时收集1998年到2006年确诊的胃癌患者组织样本278例组成队列2,用于检测YTHDF1蛋白表达水平。随后,研究团队还从TCGA数据库中选取了胃癌患者的肿瘤组织样本和癌旁正常组织样本(其中未配对组:癌旁正常组织32例,肿瘤组织375例;配对组:同一患者的肿瘤组织和癌旁正常组织各27例),目的是为了分析胃癌患者的肿瘤组织和癌旁正常组织中m6A相关基因的表达情况。结果显示,无论是在配对组还是在未配对组的肿瘤组织中,均观察到YTHDF1表达上调现象。同时,研究人员也在威尔士亲王医院收集的队列1和队列2的胃癌患者组织样本中观察到YTHDF1 mRNA水平和YTHDF1蛋白水平在胃癌患者的肿瘤组织中均出现过表达。那么,YTHDF1的表达情况与胃癌患者的预后是否相关呢?在队列1中,K-M曲线显示,YTHDF1 高mRNA表达与胃癌患者的低生存率显著相关(P=0.0164),多变量Cox回归分析中,YTHDF1 高mRNA表达是胃癌患者的独立不良预后因素(P=0.002)。在队列2中观察到,YTHDF1蛋白过表达与胃癌患者的低生存率相关(P=0.039)。YTHDF1在胃癌中过度表达,其表达与胃癌患者的低生存率相关。A:YTHDF1 mRNA水平表达情况及其与胃癌患者生存率的关系;B:TCGA队列中YTHDF1 mRNA水平的表达情况;C:YTHDF1蛋白表达情况与胃癌患者生存率的关系。为了进一步探索YTHDF1在胃癌中的生物功能,研究人员检测了12种人胃癌细胞株中YTHDF1蛋白的表达情况,发现YTHDF1蛋白在三种人胃癌细胞系AGS、BGC823、MKN74中表达相对较高。于是研究人员打算选取这三个细胞系进行YTHDF1基因敲降,结果发现,YTHDF1的敲降显著抑制了AGS、BGC823、MKN74细胞的增殖。同时,研究人员对小鼠胃癌细胞系YTN16进行了YTHDF1基因敲除,结果也观察到类似的现象。随后的功能试验显示,YTHDF1敲降/敲除后可显著抑制人和小鼠胃癌细胞的增殖和集落形成能力。YTHDF1敲降可抑制胃癌细胞株增殖A:western blot证实细胞株中YTHDF1基因敲降效果B:YTHDF1基因敲降后对胃癌细胞活力的影响C:YTHDF1基因敲降后对胃癌细胞集落形成能力的影响以上体外实验结果表明,YTHDF1有明显的促癌作用。为了探索YTHDF1在体内是否也有同样的促癌作用,研究人员分别将转染空白质粒的MKN74细胞(MKN74-shNC)和敲降YTHDF1表达的两个稳转细胞系MKN74-shYTHDF1-1和MKN74-shYTHDF1-2分别接种到小鼠皮下。结果显示,与接种MKN74-shNC的小鼠相比,接种MKN74-shYTHDF1-1和MKN74-shYTHDF1-2的小鼠,皮下肿瘤的大小和重量均明显减小。这一结论在接种转染空白质粒的YTN16-sgNC细胞和YTHDF1基因敲除(YTN16-sgYTHDF1-1和YTN16-sgYTHDF1-2)细胞的小鼠中得到了进一步验证。小鼠皮下成瘤实验D:NSG小鼠接种MKN74细胞和YTHDF1低表达细胞对皮下成瘤的影响E:NSG小鼠接种YTN16细胞和YTHDF1低表达细胞对皮下成瘤的影响体内外实验均表明,YTHDF1可明显促进胃癌细胞的增殖,为了明确其发生的相关分子机制,研究人员进一步对YTN16-sgNC细胞和YTHDF1基因敲除细胞进行了RNA测序。分析显示,在YTHDF1基因敲除细胞中,有575个基因表达上调,866个基因表达下调。基因富集分析揭示了YTHDF1基因敲除细胞中免疫调节途径基因的缺失,包括CTLA-4检查点通路和CD209 DC通路。同时,研究人员使用KEGG数据库进行基因富集分析时发现,在YTHDF1基因敲除细胞中JAK-STAT信号通路基因表达上调,T细胞受体信号通路基因表达下调。这些结果提示,YTHDF1可能在体内发挥免疫调节作用。接下来,为了探索YTHDF1的促癌作用是否依赖于免疫系统,研究团队使用了具有免疫活性的同源小鼠模型C57BL/6小鼠,在其皮下分别接种YTN16-sgNC细胞和YTHDF1基因敲除细胞。在整个持续6周的实验过程中,接种YTN16-sgNC细胞的小鼠肿瘤持续增长,接种YTHDF1基因敲除细胞的小鼠在接种1周后皮下虽均有肿瘤长出,但接种YTN16-sgYTHDF1-1的小鼠皮下肿瘤在2周后开始逐渐缩小。这说明YTHDF1的促癌作用至少部分依赖于功能正常的免疫系统。2周后,肿瘤体积变化情况既然在免疫系统正常的情况下,YTHDF1基因敲除可加快小鼠皮下肿瘤的消除,研究人员猜想肿瘤中的YTHDF1是否能在体内调节抗肿瘤免疫呢?于是,他们在C57BL/6小鼠身上分别接种YTN16-sgNC细胞和YTHDF1基因敲除细胞,并在2周后收集肿瘤,通过流式细胞术检测肿瘤微环境中的免疫细胞浸润情况。结果显示,与接种YTN16-sgNC细胞相比,接种YTHDF1基因敲除细胞的小鼠肿瘤大小和重量都有明显的减少。流式细胞仪分析显示,YTHDF1基因敲除组的肿瘤组织中浸润性免疫细胞(CD45+细胞)的比例明显高于YTN16-sgNC组(P<0.05)。在同源小鼠模型中,YTHDF1缺失可诱导肿瘤消除并增加免疫细胞浸润众所周知,T细胞(CD3+淋巴细胞)是适应性肿瘤免疫的重要组成部分,于是,研究人员进一步分析了C57BL/6小鼠肿瘤组织中T淋巴细胞的浸润情况。结果显示,YTHDF1基因敲除组肿瘤组织中,CD3+细胞和CD45+细胞比例显著高于YTN16-sgNC组,且在浸润性免疫细胞中,CD4+T细胞和CD8+T细胞数量和占比也均高于YTN16-sgNC组。由于干扰素γ(IFNγ )由活化的淋巴细胞分泌[4],因此,研究人员进一步检测了肿瘤组织中IFNγ的表达水平。与YTN16-sgNC组肿瘤组织相比,YTHDF1基因敲除组肿瘤组织中的IFNγ显著升高。有趣的是,通路富集分析显示,YTN16细胞YTHDF1敲除后,IFNGR1是JAK-STAT信号通路中的上调最明显的基因,并且在胃癌细胞株中发现,YTHDF1缺失使IFNGR1、JAK1、JAK2和STAT1蛋白表达上调。以上结果表明,YTHDF1基因敲除使IFNGR1上调进一步激活JAK-STAT1通路,从而增强肿瘤免疫监视。肿瘤细胞中YTHDF1的缺失激活了适应性抗肿瘤免疫从上文可知,肿瘤细胞中敲降YTHDF1表达后可增强适应性T细胞抗肿瘤免疫,那么,YTHDF1表达情况对肿瘤内的免疫抑制细胞有何影响呢?髓源性抑制细胞(MDSCs)是一种具有免疫抑制能力的肿瘤浸润性免疫细胞,越来越多的证据表明,MDSCs的高浸润性与不良预后和治疗耐药有关[5]。于是,研究人员通过流式细胞术检测了YTN16肿瘤组织中的MDSCs浸润情况后发现,与YTN16-sgNC组肿瘤组织相比,YTHDF1基因敲除组肿瘤组织和浸润性免疫细胞中的MDSCs比例更低。适应性抗肿瘤免疫主要依赖于树突状细胞(DC),DC将肿瘤细胞的抗原呈递给T淋巴细胞,前面结果已证实,肿瘤细胞敲降YTHDF1表达后可促进适应性T淋巴细胞的浸润。那么,YTHDF1敲降后是否也会增加DC浸润呢?于是研究人员也观察了C57BL/6小鼠肿瘤组织中DC的浸润情。结果显示,YTHDF1基因敲除组肿瘤组织中浸润性DC的比例明显高于YTN16-sgNC组,且DC表面组织相容性复合体II类分子(MHCII)表达增高,MHCII表达是DC细胞成熟的基本特征,而成熟的DC可分泌白细胞介素-12(IL-12)以增强适应性抗肿瘤免疫。随后,研究发现,YTHDF1基因敲除组肿瘤组织中IL-12明显高于YTN16-sgNC组。此外,在TCGA队列中,DC肿瘤浸润与YTHDF1 mRNA表达呈负相关。肿瘤细胞中YTHDF1缺失可招募成熟树突状细胞以上这些结果表明,肿瘤细胞中YTHDF1缺失可诱导成熟DC的募集,从而促进CD4+T细胞和CD8+T细胞的浸润,并增加细胞毒性细胞因子IL-12的分泌。研究团队为了进一步评估肿瘤组织中YTHDF1的表达是否会影响全身抗肿瘤免疫应答,他们在同一小鼠身上接种了YTN16-sgNC细胞和敲降YTHDF1表达的稳转细胞YTN16-sgYTHDF1-1。随后根据接种情况不同,研究人员将小鼠分成了3组,分别是YTN16-sgNC组、YTN16-sgYTHDF1-1组和混合组。在YTN16-sgNC和YTN16-sgYTHDF1-1组中,都是将同一细胞分别接种到小鼠的两侧。而在在混合组中,则是将YTN16-sgNC和YTN16-sgYTHDF1-1细胞分别接种到同一小鼠的左侧和右侧。结果显示,接种8周后,YTN16-sgNC组有肿瘤生长,YTN16-sgYTHDF1-1组无肿瘤生长;而混合组小鼠两侧均有肿瘤生长,但右侧肿瘤体积明显小于左侧,蛋白印迹实验证实了sgYTHDF1-1肿瘤保留了YTHDF1蛋白的丢失。这表明,YTN16-sgNC肿瘤可能导致抗肿瘤免疫的系统性抑制,反过来又允许YTN16-sgYTHDF1-1肿瘤存活。3组小鼠接种后,肿瘤体积变化情况既然YTHDF1缺失可消除具有免疫活性宿主中的肿瘤,那么接下来研究人员猜想它是否能触发持久的全身性抗肿瘤免疫反应,从而阻止未来的肿瘤植入?于是他们将小鼠分为两组,分别将YTN16-sgNC细胞和YTN16-sgYTHDF1-1细胞接种到小鼠的右背侧,接种2周后,切除右背侧肿瘤,然后将YTN16-sgNC细胞注射到左侧。结果显示,之前接种YTN16-sgNC细胞组小鼠左侧有肿瘤生长,之前接种YTN16-sgYTHDF1-1细胞组未见肿瘤生长。这些结果表明,接种YTN16-sgYTHDF1-1细胞后的小鼠,可充分触发宿主的抗肿瘤免疫,从而阻止随后接种表达正常YTHDF1细胞的肿瘤植入。总的来说,这个研究表明,YTHDF1在胃癌中过表达,并发挥促癌作用;YTHDF1缺失诱导DC细胞募集,并增加MHCII表达和IL-12分泌,进而促进CD4+和CD8 T+细胞的浸润,增加干扰素γ的分泌;YTHDF1缺失介导了肿瘤细胞中IFNGR1和JAK-STAT1信号通路的过表达,这可能有助于恢复抗肿瘤免疫的敏感性。本研究为胃癌的有效免疫治疗提供了一种新策略,YTHDF1有望成为胃癌免疫治疗的新靶点。来源:奇点肿瘤探秘 奇点糕
JITC:香港中文大学于君团队发现胃癌免疫治疗新靶点

张文宏新作:全面评价奥密克戎逃逸能力!

来源:生命科学前沿   病毒学当前,SARS-CoV-2 奥密克戎(Omicron)变异株已在全世界大范围流行,世卫组织从一开始就将其列为受关注的变异株(VOC)。该变异株被划分为四个子谱系,分别命名为:BA.1,BA.1.1,BA.2和BA.3。最初的Omicron(BA.1亚谱系)于2021年11月在博茨瓦纳和南非首次被发现,并与其衍生变异株BA.1.1(含有额外的S蛋白R346K突变)一起在几周内成为全球替代德尔塔(Delta)的主导流行株。但随后,研究者看到BA.2的比例迅速飙升,这个亚谱系迅速成为全球的主要变体。因此,迫切需要并排比较所有主要Omicron亚系对现有疫苗引发或单克隆抗体(mAb)介导的中和的敏感性。2022年4月7日,张文宏团队在bioRxiv预印本上传了一篇文章:Antibody Resistance of SARS-CoV-2 Omicron BA.1, BA.1.1, BA.2 and BA.3 Sub-lineages。使用基于VSV的假病毒研究发现通过两剂灭活疫苗(BBIBP-CorV)接种疫苗的个体的血清中和Omicron,显示出非常弱或没有中和活性,而同源灭活疫苗加强剂或带有蛋白亚单位疫苗的异源加强剂(ZF2001)显着改善了针对所有Omicron变体的中和滴度。研究进一步评估了20个单克隆抗体的中和概况,其中包括10个已经授权或批准的。大多数单克隆抗体在Omicron亚系中完全或基本上失去了中和活性,而一些单克隆抗体表现出明显的中和效果。综上所述,研究结果表明,所有四个Omicron亚系都威胁到当前疫苗和抗体疗法的有效性,突出了疫苗加强针对抗新出现的SARS-CoV-2变体的重要性。自去年11月,SARS-CoV-2 Omicron变异株在南非发现后便立即引起了全球科研人员和世卫组织的重视,并立即发出了警报。随着新兴的Omicron亚系(如BA.2)的出现,情况似乎变得更糟,据报道,BA.2本质上比BA.1更具传染性。已经发表了许多研究原始Omicron BA.1病毒的研究文章,但对BA.2和其他亚谱系知之甚少。在这项研究中,研究者构建了迄今为止所有主要的Omicron亚谱系病毒 - BA.1,BA.1.1,BA.2和BA.3,并行研究了它们对疫苗和中和抗体的免疫逃逸特性。研究者之前就报道过对恢复期或BBIBP-CorV疫苗接种血清的BA.1的中和活性显着降低。在这里,研究者显示所有多克隆血清在与其他Omicron亚系的中和活性方面也显着损失,其下降幅度与BA.1相当甚至更大,表明所有这些亚谱系与WT病毒具有非常远的抗原距离。研究者的结果与mRNA疫苗的研究非常相似,显示针对BA.2的中和抗体滴度与BA.1相似或低于BA.1。基于这些,研究者认为BA.2相对于BA.1的选择性优势应该主要归因于其更高的传播性而不是免疫逃避。另一方面,研究者表明接种同源灭活疫苗加强剂或异源蛋白质亚单位疫苗加强剂可以显着提高BA.1的中和滴度。对于其他Omicron亚系也是如此。最近,已经报道了三种重组谱系(XD,XE和XF),但它们的抗体逃避应该与这里研究的Omicron亚系没有显着差异,因为它们的S蛋白与BA.1或BA.2相同。因此,推广疫苗加强针注射仍然是预防SARS-CoV-2传播的有效手段。研究还用单克隆抗体(mAbs)研究了Omicron亚系的免疫逃逸能力。与研究者对BA.1的报告类似,大多数mAbs对BA.1.1、BA.2和BA.3的中和活性完全或大幅度丧失。但研究者确实观察到这些亚系中的某些mAbs有一些不同的中和模式,反映了它们不同的变异。例如,S309和5-7,针对RBD或NTD中的一些独特的位点,是两个据报道对BA.1基本保持活性的mAbs,但它们的活性被BA.2进一步逃逸。相反,一些mAbs如COV2-2130和2-7对BA.1完全失去了活性,但对BA.2又恢复了活性。好消息是LY-CoV1404或bebtelovimab对所有Omicron亚系和其他主要的SARS-CoV-2变体都保持有效的中和活性。该研究的数据与其他关于Omicron亚系和单一突变的mAb中和情况有很好的一致性。研究还添加了对BA.3的免疫逃逸能力研究,并将一些近距离突变结合起来,研究它们的协同作用。如上图,尽管LY-CoV1404目前仍然是我们对SARS-CoV-2治疗性抗体的希望,但鉴于RNA病毒的易突变特性,如果将其作为单一疗法长期施用,则可能会出现耐药性。因此,研究者也建议开发更有效和广泛的中和抗体作为混合治疗使用,以对抗这种不断变异的病原体。同时,疫苗加强针,无论是同源的还是异源的,都可以引发中和抗体,有助于减少病毒逃逸,应该持续推广加强针接种,并研发新型高效疫苗。
张文宏新作:全面评价奥密克戎逃逸能力!

时光倒流30年!剑桥大学通过iPS技术让衰老皮肤年轻30岁

爱美之心,人皆有之,但时光匆匆,不经意间,青丝已成白发,眼角也纹上了岁月的痕迹。对于生命而言,衰老是不可避免,这是一种系统性的磨损退化过程,直到系统无法再被修复而趋于崩溃,生命就会迎来最终的结局——“死亡”。但随着生命科学的发展,人类对衰老的认知愈加深刻,越来越多的研究证据表明衰老是可以逆转的,永葆青春并不是一种纯粹的赞美,而将逐渐成为现实。2022年4月8日,英国剑桥大学的研究人员在eLife期刊上发表题为:Multi-omic rejuvenation of humancells by maturation phase transient reprogramming的研究论文。该研究开发了一种使肤细胞恢复年轻活力的新技术,使得衰老的皮肤细胞的生物钟倒转大约30年!在模拟皮肤伤口的实验中,部分恢复活力的皮肤细胞表现出更像年轻细胞的迹象。这一技术将对再生医学的发展产生深远影响。生物衰老,不仅仅体现在外表和健康状况,还体现在体内的每一个细胞。简单来说,每个细胞都携带着一个分子时钟,记录时间的流逝,与年轻个体相比,老年个体身上分离出来的细胞在DNA上有不同的修饰标记——表观遗传标记。有趣的是,科学家们发现,一些细胞因子可以将这些表观遗传标记重置为它们原来的模式,例如著名的“山中因子”(因诺奖得主山中伸弥教授得名)——Oct4、Sox2、 Klf4和cMyc,从发育的角度讲,这种方法可以帮助研究人员将成熟的体细胞转变为干细胞,即诱导性多能干细胞(iPSC)技术。在这项最新研究中,研究团队提出了“成熟阶段短暂重编程”的新方法:研究人员将衰老的皮肤细胞暴露在山中因子下仅13天,然后让这些细胞在正常条件下生长一段时间。基因组分析显示,这些经过部分重新编程的细胞恢复了皮肤细胞特有的标记物,胶原蛋白的表达水平也趋近于年轻的皮肤细胞。诱导过程模式图为了证明这些细胞已经恢复了活力,研究小组检测了衰老特征的变化。第一个是表观遗传时钟,在基因组中存在的表观遗传标记;第二个是转录组,所有由细胞产生的基因读数。通过这两种方法衡量,重新编程的细胞相较之前年轻了30岁!该研究的第一作者Diljeet Gill博士解释说:“在过去的十年里,我们在分子水平上对衰老的理解取得了进展,使研究人员能够测量人类细胞中与年龄相关的生物学变化。我们能够将其应用到我们的实验中,以确定我们的新方法实现的重编程程度。”重编程细胞的转录组特征明显“年轻化”更重要的是,这项新技术的潜在应用不仅在于让衰老的细胞看起来更年轻,还在于重编程细胞的功能和年轻细胞一样。例如,成纤维细胞产生胶原蛋白,这是一种存在于骨骼、皮肤肌腱和韧带中的分子,有助于组织结构的形成和伤口的愈合。研究人员发现,经过重编程处理的成纤维细胞比衰老细胞更快地修复伤口。这是一个令人兴奋的结果,也许有一天这项研究最终会被用于创造更善于愈合伤口的细胞。重编程的成纤维细胞表达更多的胶原蛋白不仅如此,这项研究也为其他疾病的治疗提供了新的可能。研究人员观察到,这项新技术也对其他与年龄相关的疾病和症状相关的基因产生了影响。例如,与阿尔茨海默病相关的 APBA2 基因,以及与白内障发展有关的 MAF 基因,在重编程细胞中都表现出年轻时的转录水平。该研究的通讯作者Wolf Reik教授表示:“这项工作具有非常令人兴奋的意义。最终,我们或许能够识别出无需重新编程就能恢复活力的基因,并专门针对那些减少衰老影响的基因。这种方法有望带来有价值的发现,为再生医学打开新的大门!”重编程细胞的表观遗传修饰的变化总而言之,这项研究证明,对成熟的皮肤细胞进行短暂的重编程,可以使之恢复活力和功能,其程度相当于逆转了30年的时间!也许在不久的将来,永葆青春将不再是梦想,而是每个人的真实写照。论文链接:https://elifesciences.org/articles/71624来源:生物世界
时光倒流30年!剑桥大学通过iPS技术让衰老皮肤年轻30岁

人类肿瘤治疗的三次革命性进程

迄今为止,现代医学的发展已然有许多疾病尚未攻克,而癌症就是这其中的一个最强劲的对手,剥夺了众多人的生命。被称为“众病之王”根据2019中国国家癌肿中心发布的最新一期的全国癌症统计数据。报告显示,2015年全国恶性肿瘤发病约392.9万人,较2014年380.4万增加12.5万,增长率为3.2%。这就意味着,平均每天超过1万人被确诊为癌症,每分钟7.5人被确认为癌症。从这些数据就足以说明对手的“凶猛”,但是人类从来没有因为恐惧而停止对癌症病因、疾病机制和治疗方法的探索。肿瘤的治疗包括三大金刚:外科治疗、放射治疗、药物治疗。而这三大金刚“组合”治疗成为对抗这个顽疾的主要方法,都取得了长足的进步。值得一提的是,药物治疗也经历了三次革命,肿瘤患者的生存状况也得到了极大的改善。第一次革命:化学治疗第二次革命:靶向治疗第三次革命:免疫治疗回顾历史我们才能展望未来,下面小编就带大家一起回顾、见证下这三次革命!第一次革命:化学治疗1940年后开始出现的细胞毒性化疗药物。1943年耶鲁大学的Gilman 将氮芥用于治疗淋巴瘤取得了短暂的疗效。1948年Farber 用抗叶酸剂甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞性白血病,揭开了现代癌症化疗的序幕。此后,随着抗癌药物的研究开发,化疗药物得到了快速的发展。20世纪50年代发现的药物有:氟尿嘧啶(5-Fu)、6羟基嘌呤(6MP)、甲氨蝶呤(MTX)、环磷酰胺(CTX)、放线菌素D(Act D) 等。MTX治疗绒毛膜上皮细胞癌取得成功。20世纪60年代,大部分目前常用的化疗药物,如长春花碱(VLB)、阿霉素(ADM)、阿糖胞苷(Ara-C)、博莱霉素(BLM)、顺铂(DDP)等都已被发现;细胞动力学和抗癌药代动力学研究取得了成绩;儿童急性淋巴细胞性白血病、霍奇金病通过联合化疗已能治愈,并开始了其他实体瘤的化疗。20世纪70年代:一些肿瘤的联合化疗方案更趋于成熟,顺铂和阿霉素应用于临床,使化疗姑息性向根治性目标迈进。20世纪80年代:从植物中提取的抗癌物质——紫杉类和喜树碱类应用于临床。……常用的化疗药物有几十种,机制各有不同,但是无论机制如何,它们的统一作用都是干扰DNA的完整性,干扰DNA的复制,作用于有丝分裂纺锤体中的微管,抑制有丝分裂,阻止癌细胞的增殖、浸润、转移直到最后杀灭癌症组织。化学治疗在肿瘤治疗中的地位正日益提高,已能治愈一部分化疗敏感肿瘤如急性淋巴细胞白血病、绒毛膜上皮细胞癌、睾丸癌等,并延长晚期乳腺癌等对化疗比较敏感肿瘤的生存期。但仍有一些肿瘤对现有的化疗药物不敏感,化疗还不能延长这部分患者的生命。另外一方面,化疗药物的死穴是它们本身并不能区分恶性细胞还是正常细胞,因此化疗药物在杀死癌细胞的同时也会杀死大量人体正常的需要分裂的干细胞,这就是为什么化疗对细胞生长比较旺盛的骨髓细胞、肝细胞、肠胃表皮细胞等都有非常严重的副作用。临床上化疗药物的使用剂量必须受到严格控制:药物太少不能起到杀死癌细胞的作用,药物太多会产生过于严重的副作用,对患者造成“不可逆伤害”,甚至死亡。第二次革命:靶向治疗DNA双螺旋结构的破解,拓宽了人类对生命的认知,许多疾病都在基因层面找到了突变基因,癌症也不例外。科学家开始猜测,既然癌细胞是因为基因突变而产生的,那么是否可以针对突变位点进行针对性的治疗?在此之前,无论是手术还是放疗、化疗,都无法做到精准地杀死癌细胞,大量的正常细胞也在治疗的过程中被杀死,于是靶向药物应运而生。靶向药物又被称作生物导弹,药物进入体内会特意地选择致癌位点相结合发生作用,使肿瘤细胞特异性死亡,而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞。1987年,科学家首次确定了表皮生长因子受体对非小细胞肺癌的生长和扩散的重要作用。1997年,美国食品药品监督管理局(FDA)批准了首个分子靶向治疗药物——利妥昔单抗,用于对其他治疗无效的B细胞非霍奇金淋巴瘤的适应证,此后靶向药物就成了癌症治疗药物研究的热点,不断有新的靶向药物诞生并应用于临床。2013年,美国国家癌症研究所的科学家发布了有史以来规模最大的癌症相关基因变异数据库,为研究者研究靶向药物提供了最全面的数据库。靶向药物一般是小分子药物,需要足够小,可以轻松进入细胞,因此它们常作用于细胞内部的靶标。大多数患有某些癌症类型的患者将有某一特定药物作用的靶点,因此可以用该靶向药物治疗。但是,在大多数情况下,还需要对您的肿瘤进行检测,以确定是否有药物靶点,患者是否对药物敏感。要对肿瘤进行基因检测,可能需要做活检。活检是医生将肿瘤切除以进行检测的过程。进行活检有一些风险,这些风险取决于肿瘤的大小和位置。但是,伴随着分子靶向药的诞生,靶向药物的弊端也逐步凸显。靶向药物由于过于精准地瞄准靶点基因,一旦靶点基因发生突变,靶向药物就会失去作用。很多癌症患者在经过分子靶向治疗之后几年内,都会出现耐药情况,这将使患者的癌症进一步恶化。此外,靶向药物的研发时间长、成本高、价格昂贵,并非所有癌症患者都能承受。当科学家发现靶向药物的弊端,而且暂时无法战胜所有的癌症时,人体内的天然抗癌战士——免疫系统引起了他们的关注,并逐步成为研究的焦点。第三次革命:免疫治疗——癌症治疗史上的第三次革命肿瘤免疫治疗起源于19世纪末期,但在近30年才得以快速发展:▶ 1893年,美国纽约外科医生科利(William Coley)意外发现有一个患者左面颊部长了一个鸡蛋大小的肉瘤,虽然手术切除了两次,但仍然在左耳后出现约11厘米像葡萄串的复发肿瘤,并且术后的伤口迟迟不能愈合。更糟糕的是,患者伤口出现化脓性链球菌感染,反复伴随高热。就在医生束手无策、患者绝望之时,肉瘤竟然奇迹般缩小直至消退。这一特殊的病例引起了科利的兴趣,他意识到也许这个感染能够通过唤醒免疫防御治疗肿瘤。于是,他提取患者链球菌脓肿进行培养,再把培养好的活细菌注射给肿瘤患者。接受这种方法治疗的患者中,两名好转,两名死于感染。随后,科利开始利用灭活细菌进行试验,最终他确定了最佳的方案:使用灭活的酿脓链球菌和黏质沙雷菌混合物,这就是著名的科利毒素。虽然科利毒素因受制于不良反应、疗效等原因没能发展到今天,但不可否认,科利的研究打开了肿瘤免疫治疗的新篇章。▶ 经过了长达半个世纪的沉寂,20世纪50年代末期,澳大利亚免疫学家伯内特(Macfarlane Burnet)等人提出了“免疫监视理论”,该理论认为免疫系统具有完备的监视功能,能区分“自己”和“非己”,肿瘤中存在肿瘤抗原,能够被淋巴细胞视为“非己”而清除,这为肿瘤免疫治疗奠定了理论基础。▶ 40多年后,2002年美国肿瘤生物学家施赖伯(Robert Schreiber)提出了“肿瘤免疫编辑理论”,指出免疫系统不但具有排除肿瘤细胞的能力,还具有促进肿瘤生长的作用,免疫系统与肿瘤的相互关系分为“清除、均衡、逃逸”三个阶段。这不仅完善了肿瘤免疫治疗的理论体系,更重要的是为肿瘤免疫治疗提供了新策略。肿瘤免疫治疗被学术界认为是癌症治疗史上的第三次革命,其应用与效果是其他治疗方法无法比拟的。它主要有三个方面的优势:一是治疗时期范围更广,能治疗已经广泛转移的晚期癌症,特别是对于部分标准疗法全部失败的晚期癌症患者使用免疫治疗后,依然取得了很好的效果;二是预后好、“生存拖尾效应”显著,响应免疫治疗的患者有很大机会能够高质量长期存活,这是与化疗、靶向药物最大的区别;三是免疫治疗是广谱型的,可以治疗多种不同的癌症,使异病同治成为现实。免疫治疗同样也避免不了副作用的发生。免疫治疗相关常见不良反应包括:内分泌异常:甲状腺炎、甲状腺功能减退、甲状腺功能亢进、下垂体炎、垂体功能减退症、肾上腺功能不全;肺部:肺炎、呼吸衰竭;消化道:恶心、呕吐、腹泻、结肠炎、穿孔和胰腺炎;神经:神经病、脑膜炎、格林-巴利综合征;皮肤:黏膜炎、皮疹、白癜风;肝脏:转氨酶升高、肝炎;视力:虹膜炎、葡萄膜炎、结膜炎;心脏:心包炎;肾脏:肾炎、肾功能不全;导致这些毒副作用的原因为:T细胞浸润、细胞因子、自身抗体。结语人类为应对病痛与死亡,动员了感性与理性、个人与群体,每一次斗争的胜利和认识的深化都伴随科学技术的发展。癌症的认知经历了从宗教混沌,到细胞病毒,再到癌症基因。治疗手段也经历了从手术、放疗和化疗,到分子靶向药物,以及细胞免疫治疗,人类与癌症的斗争持续数千年。没有谁能准确预测癌症的终点,但我们坚信科技的进步将最终使“谈癌色变”成为历史。参考:《中国2019最新癌症统计数据出炉》《癌症治疗史上的革命:靶向治疗和免疫治疗》《抗肿瘤药的发展简史》《“以毒攻毒”是真的!“诺奖”背后,免疫疗法靠什么治病救人?》《收藏 | 肿瘤免疫治疗常见毒副作用及处理方法大全》来源:趣宣讲作者:Daisy Qian
人类肿瘤治疗的三次革命性进程

靶向 EGFR 突变体的 PROTAC

EGFR激活突变的非小细胞肺癌,其靶向治疗取得了巨大的进展,先后有第一、二、三代EGFR-TKI获批上市,患者临床获益明显。第一代EGFR-TKI针对的是EGFR激酶区结构中“L858R”或“exon19 del”突变,上市的代表药物有吉非替尼、厄洛替尼和埃克替尼;研究人员基于第一代EGFR-TKI苯胺喹唑啉骨架开发了第二代的EGFR酪氨酸激酶共价抑制剂,该激酶在配体结合位点附近含有半胱氨酸残基(C797),通过迈克尔受体(如丙烯酰胺)取代喹唑啉环,可以捕获半胱氨酸残基,第二代抑制剂临床效果和抗耐药性较第一代有一定提升,上市的代表药物有阿法替尼和达克替尼;第三代EGFR-TKI对“L858R”合并“T790M”、“exon19 del”合并“T790M”的EGFR突变肿瘤细胞均表现出明显抑制活性,同时具备一定选择性(不明显抑制野生型),上市的代表药物有奥希替尼、阿美替尼、伏美替尼等。为了解决耐药问题而生的奥希替尼等第三代EGFR-TKI,也不可避免地会出现了耐药现象。三代EGFR-TKI耐药机制分为EGFR相关与EGFR非相关两种,其中EGFR相关的耐药约占30%~45%,C797S突变占比20%左右,三级 C797S (Cys 797 → Ser 797 ) 突变会破坏Cys797和丙烯酰胺弹头之间的共价形成。奥希替尼与EGFR/T790M和EGFR/C797S结合作用的示意图(来源:文献2)克服含有 C797S 的 EGFR 三重突变(L858R/T790M/顺式C797S 或 Del19/T790M/顺式C797S)一般称为第四代EGFR-TKI,目前还没有该类药物上市。上述四代小分子药物,均是靶向 EGFR 三磷酸腺苷 (ATP) 结合位点的类似药物设计策略,该策略既有优势又有劣势,这些化合物可能始终难以避免遭受药物诱导的 EGFR 突变。显然需要一种新的药物设计策略来开发具有不同作用机制的化合物,在过去的十年中,由蛋白降解靶向嵌合体 (PROTACs) 诱导的靶向蛋白质降解已成为药物发现的一种有吸引力的策略。PROTAC(Proteolysis Targeting Chimera)蛋白降解靶向嵌合体,是一种杂合双功能小分子化合物,结构中含有两种不同配体,一个是E3 泛素连接酶的配体,另一个是与细胞中目标靶蛋白结合的配体,两个配体之间通过 Linker 相连,从而形成“三体”聚合物--靶蛋白配体-Linker-E3 配体。PROTAC 作用模式(来源:文献2)PROTAC 可以在细胞中与 E3 泛素连接酶和靶蛋白结合,并形成三元复合物:靶蛋白-PROTAC-E3泛素连接酶,从而导致靶蛋白的多聚泛素化并随后被 26S 蛋白酶体识别并降解。在引发靶蛋白泛素化之后,PROTAC 可从复合物中解离,并参与下一轮的催化循环。PROTAC 可能会提高蛋白质降解的选择性并逃避耐药机制,如获得性耐药突变和靶蛋白过度表达。靶蛋白降解能够实现持续的通路抑制(来源:文献3)笔者对公开报道的部分靶向EGFR常见突变体的PROTAC作以简述。2018 年,Crews 组报道了针对 EGFR del19的基于吉非替尼的 PROTAC 1,和针对 EGFR L858R/T790M的基于阿法替尼的 PROTAC 2。1处理表达EGFR del19的 HCC827(非小细胞肺癌细胞)细胞,DC50达到11.7nm,2处理表达双突变体 (L858R/T790M) EGFR 的 H1975(人肺腺癌细胞)细胞,DC50达到215.8nm。化合物1、2结构(来源:文献3)2020年,Zhang, S.-Q组发现基于第四代EGFR-TKI 的化合物3能够有效诱导EGFR del19降解,然而,3对 EGFR L858R/T790M显示出较差的降解活性。化合物3结构(来源:文献4)2020年,Jian Jin组描述了一种新型 E3 连接酶 VHL 招募 EGFR 降解剂 MS39(化合物 4)和 E3 连接酶 CRBN 招募 EGFR 降解剂 MS154(化合物 5)的发现,使用蛋白水解靶向嵌合体技术。与相应的阴性对照相比,这些化合物以 E3 连接酶依赖性方式有效诱导突变型而非野生型 EGFR 在癌细胞系中的降解,并有效抑制肺癌细胞的生长。化合物4、5结构式(来源:文献5)2020年,Zhang, S.-Q组报道含有嘌呤结构招募 VHL 的P3(化合物6),在 DC50 值分别为 0.51nM 和 126.2 nM 的 P3 处理下,EGFR del19 和 EGFRL858R/T790M 均可被显著诱导降解,化合物P3能够显著抑制EGFR通路信号转导。此外,化合物P3可显著诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期并抑制细胞集落形成。化合物6结构式(来源:文献6)2020年,XingxianZhang等报道基于奥希替尼和来那度胺的新型 PROTACs EGFR 降解剂。所有化合物均在体外进行了抗增殖作用评估,对PC9细胞、HCC827细胞和H1975细胞显示出显著的抑制作用。蛋白质印迹试验分析了EGFR降解的效果,结果显示16c(化合物7)可以通过泛素化有效地降解EGFR蛋白,并在PC9细胞中达到最大降解率(Dmax = 68%)。这些发现表明,PC9细胞中的EGFR Del19可以被设计的PROTACs有效地靶向降解。化合物7的结构式(来源:文献7)2020年,Ke Ding 等报道一系列基于 PROTAC 的选择性 EGFR L858R/T790M 突变降解剂。最有效的化合物之一14o(化合物8)可有效选择性地降解 EGFR L858R/T790M,DC50值为 5.9 nM,而对野生型蛋白没有明显作用。进一步的机制研究表明,降解是由泛素蛋白酶体途径介导的。化合物14o可用作开发新的基于 EGFR L858R/T790M降解剂的治疗的初始先导分子。化合物8的结构式(来源:文献8)2020年,Grey组报道基于变构 EGFR-TKI 的PROTAC DDC-01-163(化合物9)。重要的是,9对EGFR L858R/T790M、EGFR L858R/T790M/C797S和EGFR L858R/T790M/L718Q等耐药突变体有效。DDC-01-163在Ba/F3-EGFR L858R/T790M/C797S突变细胞中显示出有效的抗增殖作用,其IC50值为0.041 μM。化合物9结构式(来源:文献9)2021年,Biao Jiang等报道以EGFR抑制剂canertinib和CRBN配体泊马度胺为基础,合成了两个基于CRBN的新型EGFR PROTAC,SIAIS125(化合物10)和SIAIS126(化合物11)。这两种降解物在耐EGFR TKI的肺癌细胞中显示出有效和选择性的抗肿瘤活性。首先,在30~50 nM浓度范围内,它们能选择性降解H1975细胞中的EGFRL858R+T790M抗性蛋白和PC9细胞中的EGFR del19 突变蛋白。机制研究表明PROTAC可以诱导肺癌细胞自噬。PROTAC 诱导的 EGFR 降解通过泛素/蛋白体系统和泛素/自噬/溶酶体系统起作用。化合物10、11结构式(来源:文献10)2022年,Jian Li, Fang Xu,Tianfeng Xu等报道针对 Del19/T790M/C797S 突变的新型 EGFR PROTAC。研究人员介绍了一系列 EGFR 蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 的设计和合成,这些嵌合体可以在表达 EGFR Del19/T790M/C797S的 Ba/F3 细胞中快速有效地诱导 EGFR 降解突变体。一种代表性6h(化合物12)呈时间和剂量依赖性地诱导 EGFR 降解,DC50为 8 nM。它还对 Ba/F3-EGFR Del19/T790M/C797S细胞显示出良好的抗增殖活性 (IC50=0.02 μM) 。6h可作为先导化合物开发用于治疗具有 EGFR C797S 突变体的耐药性非小细胞肺癌患者的治疗剂。化合物12结构式(来源:文献11)2022年,Zhang, S.-Q组报道发现具有嘌呤结构的新型 EGFR 配体的共价 PROTAC CP17(化合物13)可作为针对 EGFR L858R/T790M和 EGFR del19的高效降解剂,DC50值非常低,此外,CP17对 H1975 和 HCC827 细胞系表现出优异的细胞活性,且具有高选择性,机理研究表明溶酶体参与了降解过程。重要的是,共价结合策略被证明对于靶向EGFR L858R/T790M的PROTAC的设计是一种有效的方法,为进一步开发有效的靶向 EGFR 的高效 PROTAC 奠定了实践基础。化合物13结构式和活性参数(来源:文献12)总结:现在常规的各代(已经上市三代)小分子EGFR抑制剂不仅面临着产品同质化严重的窘境,更是在靶蛋白突变导致耐药方面问题重重,新兴的蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 技术为清除 NSCLC 治疗道路上的耐药性障碍提供了有力工具,该研究领域热度不减,期待早日有相关药物上市,造福病患。参考:1.Lu X, Yu L, Zhang Z, et al. Targeting EGFRL858R/T790M and EGFRL858R/T790M/C797S resistance mutations in NSCLC: Current developments in medicinal chemistry[J]. Medicinal research reviews, 2018, 38(5): 1550-1581.2.曾申昕,黄文海,沈正荣. 蛋白降解靶向嵌合体在小分子药物研发中的机遇与挑战[J]. 药学进展,2020,44(11):801-816.3.Burslem G M, Smith B E, Lai A C, et al. The advantages of targeted protein degradation over inhibition: an RTK case study[J]. Cell chemical biology, 2018, 25(1): 67-77. e3.4.Zhang, H.; Zhao, H.-Y.; Xi, X.-X.; Liu, Y.-J.; Xin, M.; Mao, S.;Zhang, J.-J.; Lu, A. X.; Zhang, S.-Q. Discovery of potent epidermal growth factor receptor (EGFR) degraders by proteolysis targeting chimera (PROTAC). Eur. J. Med. Chem. 2020, 189, No. 112061.5.Cheng, M.; Yu, X.; Lu, K.; Xie, L.; Wang, L.; Meng, F.; Han, X.; Chen, X.; Liu, J.; Xiong, Y.; Jin, J. Discovery of potent and selective epidermal growth factor receptor (EGFR) bifunctional small-molecule degraders. J. Med. Chem. 2020, 63, 1216−1232.6.Zhao, H.-Y.; Yang, X.-Y.; Lei, H.; Xi, X.-X.; Lu, S.-M.; Zhang, J.-J.; Xin, M.; Zhang, S.-Q. Discovery of potent small molecule PROTACs targeting mutant EGFR. Eur. J. Med. Chem. 2020, 208, No. 112781.7.He, K. L.; Zhang, Z.; Wang, W. B.; Zheng, X. L.; Wang, X. J.; Zhang, X. X. Discovery and biological evaluation of proteolysis targeting chimeras (PROTACs) as an EGFR degraders based on osimertinib and lenalidomide. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2020, 30,127167.8.Zhang, X.; Xu, F.; Tong, L. J.; Zhang, T.; Xie, H.; Lu, X. Y.; Ren, X. M.; Ding, K. Design and synthesis of selective degraders of EGFR(L858R/T790M) mutant. Eur. J. Med. Chem. 2020, 192,112199.9.Jang, J.; To, C.; De Clercq, D. J. H.; Park, E.; Ponthier, C. M.; Shin, B. H.; Mushajiang, M.; Nowak, R. P.; Fischer, E. S.; Eck, M. J.; Jänne, P. A.; Gray, N. S. Mutant-selective allosteric EGFR degraders are effective against a broad range of drug-resistant mutations. Angew. Chem., Int. 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靶向 EGFR 突变体的 PROTAC

带你全面了解抗体药物

1抗体的发现抗体药物是生物技术制药领域的一个重要方面。抗体药物的发展并不是一蹴而就的,抗体的发现以及抗体药物的临床应用经历了一段漫长的历史进程。抗体治疗的最早应用可以追溯到中国人接种“人痘”预防天花的记载算起,国际上一般公认的人痘接种术最早起源于中国公元10世纪,但据中国的一些史书记载,种痘始于唐朝。1661年,随着因得过天花而继承皇位的康熙执政,人痘接种开始从民间走进皇宫,种痘术开始在全国得以提倡和推广。到后来的英国人Jenner受到中国人痘接种法的启示,接种牛痘预防天花,直至今日,免疫学的发展已有三个半世纪。照片为我国为边境少数民族孩子种痘,图片来源于网络。早在19世纪末,抗体被动免疫疗法的创立为当时不发达的疾病治疗开辟了新途径。Ehrlich提出的侧链学说为免疫学与免疫疗法奠定了基础。19世纪80年代后期,学者们在研究病原菌的过程中,发现白喉杆菌分泌的白喉外毒素有致病性,进而发现在感染者的血清中有“杀菌素”(bactericidins),这就是最早发现的抗体。在抗体发现早期,这种特异性的抗体物质勾起了科学家们极大的兴趣,科学家们前赴后继致力于解析抗体的结构,但由于落后的实验条件,进展缓慢。1937年瑞典物理学家Arne Wilhelm Kaurin Tiselius通过电泳技术证明了抗体也是一种蛋白质,并将其称为γ球蛋白。1953年英国生物化学家Frederick Sanger成功解析了同样身为蛋白质的胰岛素的化学结构,从而为科学家们解析抗体结构指明了方向。1963年,Edelman与RodneyRobert Porter(Sanger的第一个博士研究生)结合两人多年的研究结果,提出了比较成熟的“Y”型对称结构的抗体分子模型。1969年,Edelman和Porter完成了一项在当时了不起的成就,他们成功对抗体1300多个氨基酸序列进行了测定,是当时测定氨基酸序列的最大的蛋白质分子。在Edelman提出的抗体多样性理论的基础上,1976年,日本科学家利根川进和同事在检测不产生抗体的胚胎细胞和产生抗体骨髓瘤细胞中抗体轻链基因的分布时发现,胚胎细胞中不同抗体基因距离较远,而骨髓瘤细胞中抗体基因距离接近,这个发现说明生殖细胞在发育成免疫细胞的过程中,抗体基因发生了重新分布现象。利根川进在此基础上用一系列确凿的实验数据确定了抗体多样性是由B淋巴细胞中抗体基冈的染色体重排和突变造成的。根据估算,抗体基因通过重组和突变甚至可以编码100亿种不同的抗体,很好解释了抗体多样性产生的原因。1987年,利根川进由于抗体多样性的突破性研究独享了该年度的诺贝尔生理学或医学奖。2抗体的类型抗体重链类型直接决定了抗体的类型,哺乳动物抗体重链可分为五类,分别以希腊字母γ、α、μ、δ、和ε表示,据此将抗体相应地分为IgG、 IgA、 IgM、IgD和IgE。α和γ大约含有450个氨基酸,μ和ε约含550个氨基酸;同时μ链和ε链含有5个肽环,γ链、α链、δ链含有4个肽环。IgG是血清中一种主要的Ig,含量占总Ig的65—75%左右。广泛分布于组织液中,血管内、外间隙中分布量大体相当。是机体抗感染的一种重要物质。IgM是成熟胎儿合成的第一类Ig,也是在感染或免疫后最早产生的Ig,5类Ig中IgM最强,故其细胞毒活性和细胞溶解活性也最强。天然的血型抗体是IgM,有些自身抗体如抗磷脂抗体、RF等也属于IgM。胎儿脐血中IgM抗体升高,是胎儿遭受感染的标志。IgA在血清和组织液中的含量相对较少,血清型IgA含量占总Ig的15—25%,但在外分泌液如初乳、唾液、眼泪、肠道分泌液和支气管分泌液中含量较高。由于IgA主要存在于外分泌液中,故在第一线抗感染防御中起重要作用。IgE为单体结构,是正常人血清中含量最少的Ig。IgE在血清和组织液中含量极微,其主要生物学功能是与组织肥大细胞、嗜碱粒细胞表面的特异受体结合。IgE不能激活补体。IgE含量在正常人群波动较大,在特异性过敏反应和寄生虫早期感染患者血清中可升高。当变态反应原与结合在受体上的IgE反应时,可引起肥大细胞、嗜碱粒细胞脱颗粒,释放出组织胺、5—羟色胺等生物活性物质。IgD在正常人血清中IgD浓度很低,几乎检测不到。IgD主要存在于人B淋巴细胞表面作为抗原的细胞受体,在血清中IgD含量极微且与膜结合的IgD有不同结构。B细胞上IgD的可变区与该细胞将分泌的IgG、IgA、IgM的可变区相同,当抗原与IgD受体结合时,刺激B细胞繁殖、分化、并分泌对抗原特异的其他类抗体哺乳动物抗体轻链大约由211–217个氨基酸残基组成,共有两型:kappa(κ)与lambda(λ),同一个天然Ig分子上轻链的类型总是相同。但在同一个体内可存在分别带有κ或λ链的抗体分子。不同种属生物体内两型轻链的比例不同,正常人血清免疫球蛋白κ链:λ链约为2:1,而在小鼠的比例为20:1。其他低等脊椎动物中存在iota (I)亚型轻链,如软骨鱼类和真骨鱼类。3抗体的结构免疫球蛋白Ig由4条多肽链通过链间和链内二硫键连接组成:两条相同的相对分子质量较大的肽链(称为重链,heavychain,H链,相对分子质量约为55000或70000)和两条相同的相对分子质量较小的肽链(称为轻链,light chain,L链,相对分子质量约为24000)组成。让我们把抗体想象成在人的血液里飘浮着的成千上万个双齿的小叉。每个小叉的每个齿都可以黏结一个特定抗原的一个特定部位,这样一个双齿叉可以结合两个同样的抗原。抗原则可以是外来或病变的蛋白,甚至包括入侵病原体(真菌、细菌、病毒等)的RNA、DNA或多聚糖。1.可变区(Variable Region,V区)抗体小叉与小叉之间在结构上的主要差异是位于齿端的可变区——这些可变区决定着抗体的抗原特异性。H链可变区约含118个氨基酸残基和L链可变区约含108~111个氨基酸残基。可变区是抗体结合抗原的位置,其氨基酸的组成和排列决定抗体的抗原结合特异性。可变区存在一些氨基酸能够高频变化组合的区域,这些区域称为超变区(hypervariable region,HVR),超变区又称为互补决定区(complementarity-determining region, CDR),超变区决定了抗体的独特型(抗独特型抗体表达)。可变区中非HVR部位的氨基酸组成和排列相对比较保守,称为骨架区(framework region,FR区)。VL中的CDR有三个,通常分别位于第24~34,89~97位氨基酸残基,其中CDR3超变程度更高,抗体的特异性和亲和力成熟主要涉及到该区域的改造。2.恒定区(Constant Region, C区)抗体小叉的柄部由一系列氨基酸序列基本不变的区域组成——我们称之为恒定区。恒定区可以与细胞表面受体或补体系统蛋白相互作用,从而触发宿主效应功能(effector function),比如裂解入侵细胞或吞噬外来病原。抗体恒定区域位于H链靠近C端的3/4或4/5(约从119位氨基酸至C末端) 和L链靠近C端的1/2(约含105个氨基酸残基)区域。抗体重链恒定区分为CH1,CH2和CH3,其中CH3区域涉及到细胞膜表面受体结合,CH2涉及补体激活途径,是补体结合位点。简单来说,叉齿负责识别抗原,而叉柄则帮助宿主决定如何处置抗原。3. 抗体Fab段和Fc段IgG经木瓜蛋白酶酶切后裂解为2个完全相同的Fab段和1个Fc段,每个Fab段都为单价,可与抗原结合但不会再发生凝集反应;经胃蛋白酶酶切后裂解为1个完整F(ab)2片段和碎片化的Fc片段,F(ab’)2片段为双价,可同时结合两个抗原表位。Fab段为抗原结合片段(fragment of antigen binding,Fab),相当于抗体分子的两个臂,由一个完整的轻链和重链的VH和CH1结构域组成。Fc段为可结晶段(fragmentcrystallizable,Fc)相当于Ig的CH2和CH3结构域,是Ig与效应分子或者细胞相互作用的部位。Fab段包含完整的可变区,以及恒定区的CH1区域。Fc段仅指Ig恒定区CH2和CH3的区域,相当于Y字结构下面那一部分。4. 重链抗体的结构骆驼类和软骨鱼类中天然缺失轻链的抗体又被称为重链抗体,存在于亚洲的西亚骆驼(Camelusbactrianus)、非洲的单峰驼(C.dromedarius)和南美的大羊驼(Lama glama)、原驼(L.guanicoe)、羊驼(Vicugna pacos)和小羊驼(V.vicugna)等骆驼科中。1995年又在护士鲨(Ginglymostoma cirratum)、斑纹须鲨(Oretolobus maculatus)、银鲛等软骨鱼中发现了无轻链或其他蛋白分子伴随的类似于重链抗体的抗原受体(new or nurse shark antigen receptor,NAR)。由于NAR分子与Ig亚型在跨膜和分泌方式等几个功能特征方面近似,因此也被称为免疫球蛋白新抗原受体(Ig new antigen receptor,IgNAR)。重链抗体具有广泛应用价值的是单域重链抗体(single domainantibody,sdAb)部分。单域重链抗体是指仅由重链抗体可变区(Variable region)组成的基因工程抗体,又称为VHH抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH antibody)或纳米抗体(Nanobody,Nb),分子量为12-15 kD。4治疗性抗体的发展阶段自1986年第一个治疗性抗体进入临床以来,治疗性抗体得到了迅速的发展,到目前为止,FDA共批准了近百个治疗性抗体药物,其已成为现代生物医药的重要组成部分。伴随现代科技的发展,治疗性抗体经历了鼠源性抗体,嵌合抗体,改性抗体和表面重塑抗体(部分人源化抗体),以及全人源化抗体等不同发展阶段。第一代:鼠源单抗(momab)1986年,也就是在Milstein和Kohler凭借单抗杂交瘤技术获得诺贝尔奖后的第二年,强生的Orthoclone OKT3成为第一个被美国FDA批准的单抗药,用于防止肾脏移植后的宿主排斥。但直到9年以后,第二个抗体药——礼来和强生的ReoPro——才于1995年在美国上市,被用来抑制血栓形成。第一个单克隆抗体药Orthoclone OKT3来自于小鼠,它的氨基酸序列都是鼠源的。鼠源抗体在给病人服用过程中常常遇到一些问题:1)人体把这些单抗药当作异体蛋白,会产生免疫排斥。2)免疫排斥使单抗药很快从病人体内被清除掉,大大降低了它们应有的疗效。尤其治疗慢性疾病需要长期服用的情况下,鼠源单抗药在后续注射时疗效甚微;3)少数病例中,鼠源抗体会引起严重的过敏反应,甚至导致了个别病人的死亡。因此,早期单抗药的销售始终没有腾飞——Orthoclone OKT3的年销售额仅有1千万美元左右。单抗药要想在江湖上立足,要想在医学上有更广泛的应用,必须要转变成人源化抗体或人源抗体。第二代:人鼠嵌合单抗(ximab)和人源化单抗(zumab)这里我们有必要区分一下人源化抗体和人源抗体。人源化抗体一般是以鼠源抗体为基础,通过更换蛋白片断和置换部分氨基酸序列, 使抗体的最终氨基酸序列更接近人源的。而人源抗体是任何能被人体B细胞表达的抗体,其氨基酸序列是100%由人的基因编码的。20世纪90年代,以美国为主出现了几十家生物技术公司。他们个个身怀绝技——他们的技术平台都是围绕如何将抗体人源化或直接产生人源抗体而建立的,他们的目的都是将抗体药发扬光大。以研发抗体药为主的公司在当时的江湖上分两大流派。第一个流派可以称之为抗体蛋白工程派或人源化派。单抗在小鼠中产生后,它的部分氨基酸序列或被置换,或被拼接组合,其最终目的是既不引起人的免疫排斥,又不降低它对靶抗原的亲和性。这一流派又分为两个层次。第一个层次是嵌合抗体(Chimeric antibody):  抗体的恒定区都被置换成人的氨基酸序列。嵌合单抗蛋白约33%的氨基酸序列来自小鼠,其余67%为人源的。第二个层次是人源化抗体(Humanized antibody),即拿到针对某抗原的小鼠抗体后,只取其识别抗原的几段区域(CDR区域),把它们移植到人源抗体中。人源化单抗中人源的序列占90%。人源化单抗显然比嵌合单抗更有优势,引起免疫排斥或超敏的风险更低。人源化单抗技术的代表公司为Protein Design Labs, 或PDL。基因泰克几个著名的单抗药——Herceptin, Xolair和Avastin——的人源化都需要获得PDL的技术许可。人源化单抗技术最大的缺点是缺乏通用的方法。每个抗体分子的人源化,都需要个案分析、分子建模、大量的改造和试错。即使这样,由于鼠源序列的存在,人源化单抗还是不能完全避免免疫排斥或超敏的风险。第三代:全人源化单抗(mumab)抗体药的第二个流派是全人源单抗。这一流派又分为两大门派:噬菌体展示和转基因小鼠。用噬菌体展示技术产生抗体完全避免了动物的使用。在这一技术中,先通过PCR技术建立一个以噬菌体质粒为载体的、表达无数个人源抗体可变区的基因库。当大肠杆菌被这些质粒转染后,千百万个噬菌体被释放出来。每个噬菌体表面呈现一个独特的抗体可变区片断。含有这些噬菌体混合物的溶液,在流过附着特定抗原的固态基质后,粘在基质表面、洗不走的往往是呈现特异性抗体的噬菌体颗粒。特异性抗体的基因再进一步被扩增、纯化。这一流派的代表公司包括CAT和Dyax。转基因小鼠技术出道虽晚,但技术优势却最为明显。该技术通过转基因的手段把小鼠自身的抗体表达系统破坏掉,再引进人的抗体生成系统。这种转基因小鼠针对某种抗原就可以直接产生全人源的抗体。噬菌体展示和转基因小鼠在执行过程中各有千秋。一般来说,噬菌体展示技术“先快后慢”,即找到针对某种靶蛋白的抗体很快,但选出的这个抗体和靶蛋白的亲和性往往不高,需要人工细调,更换个别氨基酸。优化这一步费时费力,而且即使优化的抗体和通过转基因小鼠出来的抗体相比,亲和力可能还是相差一个数量级。另外,在优化的过程中需要替换一些氨基酸,也就引进了被免疫排斥的风险。转基因小鼠技术是“先慢后快”,将抗原注射到小鼠体内、产生特异抗体、制备杂交瘤细胞等前几步需要几个月的时间。但一旦最初的抗体产生,其优化过程在小鼠体内继续完成,又快又好,并且不用担心免疫排斥的问题。在这里要不得不提到全球第一个上市的全人源抗体—阿达木单抗(修美乐)。阿达木单抗始于1993年巴斯夫子公司BASF Knoll和剑桥抗体技术公司(Cambridge Antibody Technology,CAT)的合力研究。剑桥抗体技术以TNFα为抗原使用它们特有的噬菌体展示技术在体外筛选中得到了全人抗体D2E7。在随后的研究中,BASF Knoll进一步对全人抗体D2E7进行了完善,并完成了前期的生产工艺开发和临床申报。2002年6月,美国雅培制药(Abbott)以69亿美元收购BASF Knoll,获得了全人抗体D2E7的开发生产和销售权,最终将阿达木单抗推向市场。自2002年首次获得FDA批准上市以来,阿达木单抗已经累计创造了1161亿美元的销售收入,2017年的美国市场增速为18.5%,全球市场增速为14.6%,因此直到今天仍然以每年两位数的增幅刷新单只药品的年度销售记录。 小结抗体药物从发现到进入临床应用,经历了曲折而又漫长的历程。在这段时间里,人们对于抗体药物的认识发生了巨大的变化。在过去的十年里,抗体已经成为医药市场上最畅销的药物。预估 2021 年全球十大畅销的药物中,就会有 5 个抗体类药物。因此,随着抗体类药物被批准用于治疗各种包括癌症、自身免疫、代谢和传染病,治疗性抗体药物的市场必会呈现爆炸式增长的态势。来源:生物药学科普
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浙大和药大团队发现肠癌细胞竟会“丢弃”抑癌因子

环状RNA(circRNA)是一种新兴的内源性非编码RNA(ncRNA),它们参与细胞增殖、粘附、凋亡和存活等多个生物学过程。近年来,circRNAs在肿瘤领域也获得了越来越多的关注。有研究表明许多circRNA能促进细胞周期发展,抑制或诱导肿瘤细胞凋亡以及抑制血管生成等等,各种不同的circRNAs在肿瘤发生发展过程中起着不同甚至相反的作用。虽然越来越多的研究报道了乳腺癌、肺癌和结直肠癌中异常的circRNAs,但circRNAs在肿瘤细胞中的生物学功能、分子机制和环状模式尚不清楚。此外,还有研究提出circRNAs可以通过病理功能未知的外泌体分泌到循环中,且比线性RNAs更容易被分选进入外泌体。然而,circRNAs的外泌体特异性分选机制也仍然完全未知。近日,来自浙江大学张红河和中国药科大学来茂德领衔的研究团队,阐明了circRHOBTB3在结直肠癌(CRC)进展中的生物学作用、环化过程和分泌途径,这一结果发表在Molecular Cancer期刊上。他们发现,抑瘤circRHOBTB3通过外泌体被癌细胞排出,以维持结直肠癌细胞的活性。此外,他们还设计了靶向circRHOBTB3的环状化和分泌元件的反义寡核苷酸(ASOs),用于CRC的治疗。circRHOBTB3是宿主基因RHOBTB3转录后剪接和环状化而产生的一种circRNA。RHOBTB3作为Rho GTPase家族ATP酶,参与膜转运和蛋白酶体降解。先前的研究也表明circRHOBTB3在CRC、卵巢癌、胃癌和肝细胞癌(HCC)中作为肿瘤抑制circRNA。然而,它的循环模式和外泌体分泌途径并未被阐释。首先,研究人员分析了来自GEO数据库的12例CRC患者、21例HCC患者、32例胰腺腺癌(PAAD)患者和14例健康供体的血清外泌体的总RNA-seq数据。结果显示,许多circRNAs在肿瘤患者血清外泌体中的表达程度不同(图1A),但在所有三种癌症来源的外泌体中,只有hsa_circ_0007444(circRHOBTB3)均表达上调(图1B),且其宿主基因RHOBTB3在三种肿瘤组织中的表达与正常组织相比均无显著性的增强(图1C)。图1 不同类型癌症中ircRHOBTB3在患者血清外泌体中的表达情况然而,对来自浙江大学医学院邵逸夫医院体检的18例CRC患者和16例健康供者的血清样本数据分析发现,与健康供者相比,circRHOBTB3在CRC组织中显著下调,而宿主基因RHOBTB3显著上调(图2左二)。而且,在69个CRC组织样本中检测到的circRHOBTB3的表达结果显示,circRHOBTB3水平较高患者的总生存期更好(图2右一)。图2 ircRHOBTB3在CRC组织中患者血清外泌体中的表达情况于是,研究者不禁假设,circRHOBTB3是否具有抑癌作用?为了验证这一点,他们先确定了CRC患者血清外泌体中的circRHOBTB3确实来源于肿瘤细胞而非基质细胞(图3A),且circRHOBTB3水平在来自NCM460细胞(正常的肠上皮细胞系)的外泌体中最低(图3B)。进一步在RKO、HCT116细胞(CRC细胞系)中过表达或敲低circRHOBTB3,结果表明circRHOBTB3可以抑制细胞迁移和侵袭能力(图3C)。图3 circRHOBTB3来源与功能的体外验证实验并且,他们通过对circRHOBTB3敲除/重新表达细胞系RNA-Seq数据的分析,以及RT-qPCR验证发现,在circRHOBTB3敲除的细胞系中代谢、增殖和上皮间充质转化(EMT)通路相关基因显著上调,而circRHOBTB3的重新表达降低了这些基因的表达。此外,circRHOBTB3敲除的细胞系中ROS水平也显著升高。他们还发现circRHOBTB3的结合蛋白是ENO1和ENO2。也就是说,circRHOBTB3可能通过与ENO1和ENO2等代谢酶相互作用,调节细胞内ROS水平,抑制肿瘤细胞增殖和EMT。为了验证circRHOBTB3在体内的功能,研究人员将过表达circRHOBTB3的HCT116细胞(CRC细胞系)皮下注射到裸鼠体内,构建了异种移植瘤模型。研究发现,与不表达circRHOBTB3的对照(EV)组相比,circRHOBTB3过表达(circRHOBTB3-OE)组的肿瘤体积和重量都显著更小,且细胞增殖能力也更弱(图4A、B、C)。而当他们在裸鼠脾脏接种实验中观察肝转移表型时发现,circRHOBTB3-OE组肝转移灶少于EV组(图4D、E)。更为有趣的是,circRHOBTB3可以在异种移植瘤小鼠模型的血浆和尿液中检测到,而在野生型小鼠的血浆和尿液中则没有。此外,circRHOBTB3-OE组的血浆中circRHOBTB3的水平高于EV组(图4F、G)。图4 circRHOBTB3功能的体内验证实验根据这些数据,研究者们推测CRC细胞必须通过外泌体分泌抑制肿瘤的circRHOBTB3来维持肿瘤侵袭和转移的特征,换言之,CRC细胞有特殊的“排毒”机制。在随后的研究中,研究人员发现了circRHOBTB3的环化机制,还发现circRHOBTB3本身的顺式元件(141–240nt,141-165nt,216-240nt)可以调节circRHOBTB3通过外泌体的分泌过程(图5)。图5 转染了截断的circRHOBTB3载体的细胞中circRHOBTB3外泌体分泌丰度之前已经有研究发现,ESCRT-II亚复合物作为一种RNA结合复合物,可以将RNA分选至外泌体中。在该文研究中,他们发现SNF8可以结合到circRHOBTB3的141-240nt区域,促进circRHOBTB3被分选至外泌体并分泌到胞外。他们将这个过程被定义为“肿瘤外泌体逃逸机制”(图6)。图6 SNF8敲低实验以及外源的RIP实验受上述研究结果启发,研究人员设计了二代ASOs,以增加circRHOBTB3的环化并减少分泌,这有望成为一种新的癌症治疗策略。研究人员设计了三种二代ASOs:一个靶向负环化的元件(ASO-cir:266-290nt)和两个外泌体分泌的元件(ASO-exo1:141-165nt,ASO-exo2:216-240nt)(图7)。通过实验他们发现,ASO-cir确实能增加circRHOBTB3的环化,但circRHOBTB3的分泌却会同时增加;而ASO-exo1和ASO-exo2中,仅ASO-exo2(以下简称ASO-exo)既增加circRHOBTB3的胞内水平,又阻断circRHOBTB3外泌体的分泌。因此,研究者们考虑进一步使用ASO-cir和ASO-exo,研究二者联合治疗对结直肠癌的特异性和抗肿瘤效果。图7 二代ASOs及其作用机制研究人员验证了ASOs的联合用药的确比ASO-cir和ASO-exo的单独用药能产生更多的胞内circRHOBTB3,且小鼠实验的结果符合预期:ASO-cir联合ASO-exo确实显著提高了脾脏原发病灶中circRHOBTB3的表达,还可显著减少肿瘤恶病质,且能控制转移(图8)。图8 ASOs体外及体内实验总的来说,这项研究成果阐明了circRHOBTB3调节细胞间ROS和代谢途径来抑制CRC的进展的机制,还且提出了一种新的肿瘤逃逸理论,即肿瘤细胞通过“排泄”肿瘤抑制circRNA来维持癌细胞的活性(“肿瘤外泌体逃逸机制”)。更重要的是,他们设计的二代ASOs可以通过靶向环化和分泌来调控肿瘤抑制circRNA,以此促进癌症的治疗效果。且他们的临床数据显示,在CRC患者中,85.7%(30/35)的肿瘤样本携带的circRHOBTB3水平低于配对的正常样本,而肿瘤样本中circRHOBTB3的低表达与较差的预后相关。这让我们更加相信,这种ASOs将成为未来针对CRC的一种有前途的治疗策略。
浙大和药大团队发现肠癌细胞竟会“丢弃”抑癌因子

肿瘤免疫与细胞焦亡

前言 肿瘤对凋亡的抵抗和免疫抑制的肿瘤微环境是肿瘤治疗反应差的两个主要原因。细胞焦亡是一种不同于细胞凋亡的溶解性和炎症性程序性细胞死亡途径,最新的证据表明,肿瘤细胞中的细胞焦亡诱导导致强烈的炎症反应和显著的肿瘤消退。 作为其抗肿瘤作用的基础,细胞焦亡是由促进孔隙形成的gasdermin蛋白介导的,该蛋白通过释放促炎细胞因子和细胞破裂后的免疫原性物质促进免疫细胞活化和浸润。然而,考虑到其炎症性质,异常性的细胞焦亡也可能与肿瘤支持性微环境的形成有关。因此,深入了解细胞焦亡的分子途径,理清细胞焦亡与癌症之间复杂的联系,有助于我们充分利用细胞焦亡,并将其应用于现有的或新的抗癌策略。 细胞焦亡 上世纪90年代,在感染鼠伤寒沙门氏菌( S.typhurium )和福氏沙门氏菌的巨噬细胞中首次描述了细胞焦亡。虽然最初被认为是一个凋亡过程,但进一步的研究表明,这种细菌诱导的细胞死亡严重依赖于caspase-1。焦亡细胞与凋亡细胞有一些共同特征,如染色质浓缩和DNA断裂,但可通过其完整的细胞核、孔隙形成、细胞肿胀和渗透溶解来区分。 通常,焦亡细胞破裂是通过结合损伤相关分子模式( DAMP )或病原体相关分子模式( PAMP )后,通过半胱氨酸蛋白酶介导的成孔GSDM蛋白活化实现的。这些相同的半胱氨酸蛋白酶也可能直接或间接促进促炎细胞因子的成熟,这些促炎细胞因子与DAMP一起,在释放时启动或维持炎症反应。 虽然细胞焦亡在病原体分解中起着重要的保护作用,但它已被认为是几种人类疾病的复杂因素,如心血管疾病、神经退行性疾病和艾滋病。糖尿病等代谢紊乱也可能通过慢性炎症和胰岛素干扰性细胞因子的产生而促进细胞焦亡。在癌症中,细胞焦亡的作用似乎是把双刃剑。一方面,细胞焦亡可迅速导致肿瘤消退,另一方面,它可促进肿瘤微环境的发展。因此,癌细胞可能抑制或刺激细胞焦亡,以支持其进展,具体取决于环境。 细胞焦亡的分子机制 尽管已知的细胞焦亡途径的数量在未来可能会增加,但目前已有两条主要途径和几种替代途径被阐明。在主要途径中,细胞焦亡是由GSDMD诱导的,涉及炎症性caspase-1( 经典途径 )或caspase-4/5( 非经典途径 )。在替代途径中,最受广泛关注的是GSDME通过caspase-3诱导的细胞焦亡。 经典炎症小体途径 在经典的炎性小体途径中,模式识别受体( PRR )识别DAMP( 例如纤维蛋白原、热休克蛋白、DNA )和/或PAMP( 例如鞭毛蛋白、聚糖、脂多糖 )导致被称为炎性小体的相应胞质信号复合物的激活,通常由传感器蛋白、适配器和效应器半胱氨酸蛋白酶组成。 尽管多种PRR,如NLR和TLR参与了这一过程,但已知其中只有部分能够直接组装炎症小体并激活半胱氨酸蛋白酶caspase-1。具体而言,该亚群中的PRRs/炎症小体传感器包括NLR家族的NLRP1、NLRP3、NLRP4、AIM2和pyrin。激活后,这些传感器中的大多数与适配蛋白ASC相互作用,后者通过前半胱氨酸蛋白酶-1的募集和切割激活caspase-1。除了释放和激活GSDMD的致死N端结构域( GSDMD-N ),caspase-1还使前IL-1β和前IL-18成熟为IL-1β和IL-18,它们通过GSDMD-N形成的坏死膜孔释放。 非经典炎症小体途径 与标准炎症小体途径相反,非标准炎症小体途径不依赖caspase-1,而是依赖于caspase-4和caspase-5以及小鼠的caspase-11。这些半胱氨酸蛋白酶的激活是通过LPS与相应的前半胱氨酸蛋白酶的直接结合发生的,并且绕过了炎症小体传感器。尽管这些半胱氨酸蛋白酶不直接激活IL-1β和IL-18,但它们通过GSDMD裂解触发细胞焦亡导致钾离子外流,从而激活NLRP3炎症小体并上调caspase-1的作用。 替代途径 研究表明,在某些情况下,如化疗或靶向癌症治疗,可通过caspase-3诱导凋亡到焦亡的途径。尽管caspases-3主要与凋亡执行和形态学改变有关,但它可以通过切割GSDME介导细胞焦亡,这同样导致GSDME-N孔的形成和膜的通透性改变。当GSDME水平较高时,caspase-3激活后会迅速引发细胞焦亡,但当GSDME水平较低时,则会引发凋亡。然而,这一概念仍需要进一步的验证。 此外,还有其他几种替代性细胞焦亡途径,包括caspase-8对GSDMD的切割;caspase-8 或颗粒酶B( GzmB ) 对GSDME的切割 ;caspase-1 或颗粒酶A( GzmA ) 对GSDMB的切割 ;通过caspase-8切割GSDMC,GSDMC通过缺氧激活的程序性死亡配体1( PD-L1 )和pSTAT3转录上调以及其它未知机制形成的GSDMA孔。 癌症中的细胞焦亡及其成分 细胞焦亡在癌症中的模糊作用似乎与细胞类型、遗传学和诱导持续时间有关。在异常表达和延长活性后,GSDM、炎症小体和/或促炎细胞因子可通过诱导免疫抑制细胞、促进上皮细胞向间质细胞转化以及上调基质金属蛋白酶以进行细胞外基质重塑来促进肿瘤病理学。另一方面,与这些效应并列,细胞焦亡也可以抑制肿瘤,例如,在肝细胞癌模型中,通过NLRP3炎性小体激活诱导的细胞焦亡显著抑制了肿瘤的转移和生长。 鉴于细胞焦亡的双重作用,其分子成分在不同癌症中存在差异表达。GSDMs在乳腺癌、胃癌、宫颈癌和肺癌等肿瘤中,已被证明同时作为癌基因或肿瘤抑制因子控制增殖、转移、治疗抵抗和抗肿瘤免疫。 在胃癌( GC )中,GSDMD表达显著降低,并导致体外和体内肿瘤增殖增强。相反,非小细胞肺癌( NSCLC )中的GSDMD蛋白水平显著升高,并且与肿瘤转移以及更差的预后相关。与GSDMD类似,GSDME在胃癌、乳腺癌和大肠癌中的表达也降低。GSDMC在大肠癌中表达明显上调,在大肠癌中,GSDMC在体外促进了癌变和增殖,在体内促进了肿瘤生长。GSDMB水平越高,乳腺癌患者的转移率越高,生存率越低。 在其他细胞焦亡成分中,观察到大多数结直肠癌肿瘤中AIM2表达显著降低或缺失,且与患者预后不良有关。NLRP1水平在大肠癌肿瘤组织中同样降低,并与转移增加和生存率降低有关。乳腺癌患者组织中的caspase-1 mRNA水平显著降低,此外,caspase-1的缺失与前列腺癌和大肠癌的肿瘤发生有关。 阐明细胞焦亡与癌症之间的关系需要更广泛的研究。一个面临的挑战将是识别每种细胞焦亡分子成分的肿瘤特异性作用。由于多条通路导致细胞焦亡,且多个成分重叠,因此,表征每条通路的整体肿瘤特异性效应,而不是每个成分的个体效应,可能是理解和/或预测肿瘤对细胞焦亡调节的更有效策略。 细胞焦亡与抗肿瘤免疫的关系 细胞死亡引发适应性免疫反应的能力称为免疫原性细胞死亡( ICD )。与基本上是免疫耐受过程的凋亡不同,细胞焦亡具有诱导强烈炎症反应的分子机制,在某些情况下被认为是ICD的一种形式。虽然细胞焦亡与抗癌免疫之间的联系尚不清楚,但越来越多的研究表明,细胞焦亡介导的肿瘤清除是通过增强免疫激活和功能实现的。 GSDMA 研究发现,将GSDMA的小鼠亚型Gsdma3选择性地递送到人类HeLa、小鼠EMT6和小鼠4T1癌细胞,导致20-40%的细胞发生细胞焦亡。在体内模型中,通过静脉或瘤内注射NP–Gsdma3进行三轮治疗,导致肿瘤明显缩小。与PBS对照组相比,NP–Gsdma3治疗的肿瘤中CD4+、CD8+、自然杀伤( NK )和M1巨噬细胞数量增加,但单核细胞、中性粒细胞、髓源性抑制细胞和M2巨噬细胞的数量减少。此外,除了在血清和肿瘤水平IL-1β、IL-18和HMGB1水平增加外,还发现许多免疫刺激和抗肿瘤效应基因( 如Cd69、Gzma、Gzmb )的上调,各种免疫抑制和肿瘤前体基因( 如Csf1、Vegfa、Cd274 )下调。 GSDMD 通过研究CTLs在肺鳞状细胞癌( LUSC )和黑色素瘤肿瘤样本中与CD8+T细胞标记物有关的GSDM基因的表达,发现在五个GSDM基因成员中,只有GSDMD表达与CTL中的CD8+T细胞标记基因( 例如CD8A、CD8B、PRF1、GZMA、GZMB和IFNG )呈正相关。进一步研究表明,与原始T淋巴细胞相比,OT-1小鼠活化的CTL中GSDMD的表达显著增加。类似地,人CD8+T细胞在激活后上调GSDMD,肿瘤浸润淋巴细胞( TIL )中可见高水平的GSDMD蛋白。 此外,GSDMD敲除后,CTL对3LL-OVA细胞的细胞毒性降低。使用人CTL和H1299非小细胞肺癌细胞系记录了类似的结果。考虑到CTL杀死肿瘤细胞的一个关键途径是通过将细胞毒性分子释放到它们形成的免疫突触中,推测GSDMD和GzmB进入效应癌细胞可能是研究中发现的CTL细胞毒性的潜在机制。 GSDMB GSDMB介导细胞焦亡与GzmA密切相关。在HEK-293F细胞中的五种人类颗粒酶中,发现只有GzmA以类似于NK细胞杀伤试验的模式快速切割GSDMB。当GzmA电穿孔到GSDMB重组的293T细胞中时,引起广泛的GSDMB裂解和细胞焦亡。同样,在生理条件下,GzmA介导的GSDMB切割在NK细胞杀伤293细胞时也是必需的。 值得注意的是,其他GSDMB水平不明显的癌细胞系,如OE33( 食管癌细胞 )和HCC1954( 乳腺癌细胞 ),可通过暴露于通常由活化的CTL释放的细胞因子( 如IFN-γ和TNF-α )来转录诱导GSDMB表达增加。反过来,IFN-γ启动显著增强了这些细胞系的细胞焦亡,这种效应最终取决于GzmA。 总之,这些发现不仅表明GSDMB介导的细胞焦亡作用于GzmA下游,而且细胞毒性淋巴细胞可将GzmA传递到表达GSDMB的癌细胞中,以促进抗肿瘤免疫。 GSDME 研究发现,GSDME介导的细胞焦亡与GzmB相关。在小鼠4T1E乳腺癌细胞中异位表达小鼠GSDME( mGSDME ),在体内模型中可显著抑制4T1E肿瘤生长,并导致NK细胞和肿瘤相关巨噬细胞( TAM )浸润增加。此外,当受到刺激时,肿瘤中表达GzmB和穿孔素的NK细胞和CD8+TIL增加。 进一步研究表明,人NK细胞系YT可以激活表达GSDME的HeLa细胞中的细胞焦亡,这种诱导是通过GzmB实现的,它不仅在与caspase-3相同的位置切割GSDME,而且间接激活caspase-3。 此外,CAR-T细胞可以通过穿孔素和GzmB释放,在B细胞白血病和实体瘤细胞中诱导GSDME介导的肿瘤细胞的细胞焦亡。用共同培养的CD19-CAR-T细胞和癌细胞( NALM-6、Raji或原发性B白血病细胞 )的上清液处理人源性巨噬细胞,可促进巨噬细胞激活caspase-1,切割GSDMD,并释放IL-6和IL-1β。同时发现共培养上清液中的ATP和HMGB1分别足以促进巨噬细胞IL-1β分泌和IL-6上调。总的来说,这些发现表明CAR-T细胞治疗通过GSDME促进的细胞焦亡诱发CRS,对CD19-CART细胞治疗前患者的肿瘤细胞进行分析,显示GSDME水平升高与更严重的CRS相关。 细胞焦亡在抗癌治疗中的应用前景 近年来,越来越多的研究表明,利用细胞焦亡通过不同的靶向和传递方法进行抗肿瘤免疫的可行性和治疗潜力。 例如,利用肿瘤细胞衍生微粒( TMP )将甲氨蝶呤注入胆管癌( CCA )细胞,以诱导GSDME介导的细胞焦亡,从而激活患者衍生的巨噬细胞,并将中性粒细胞募集到肿瘤部位进行药物导向的肿瘤破坏。此外,当这种甲氨蝶呤TMP输送系统注入肝外CCA患者的胆管管腔时,25%的患者观察到中性粒细胞活化和胆道梗阻的缓解。 此外,还发现GSDME介导的细胞焦亡通过BRAF和MEK抑制剂的组合在黑色素瘤中引起免疫细胞浸润/激活,并导致黑色素瘤消退。在另一种策略中,二甲双胍是治疗2型糖尿病最常用的药物,其可以通过caspase-3间接激活细胞焦亡来抑制癌细胞增殖。 一系列针对KRAS、EGFR或ALK突变型肺癌的小分子抑制剂也被发现,在线粒体固有凋亡途径激活后,通过caspase-3介导的GSDME裂解诱导细胞焦亡。在乳腺癌细胞中,用RIG-1激动剂治疗可触发外源性凋亡途径和细胞焦亡,激活STAT1和NF-κB并上调淋巴细胞募集趋化因子。因此,在小鼠中RIG-1激活后,乳腺癌转移和肿瘤生长的减少伴随着肿瘤淋巴细胞的增加。 几乎所有抗癌免疫治疗策略面临的另一个主要障碍是免疫抑制肿瘤微环境引起的失调。为了解决这个问题,Lu等人设计了含有嵌合共刺激转化受体( CCCR )的NK92细胞,该受体将抑制性PD-1信号转化为激活信号,有效地增强了抗肿瘤活性。在体外,CCCR-NK92细胞通过GSDME介导的细胞焦亡迅速杀死H1299细胞,在体内显著抑制肿瘤生长。 此外,越来越多令人兴奋的研究报告表明,细胞焦亡诱导与PD-1抑制剂协同作用使肿瘤由“冷”变“热”,表明这种组合的巨大潜力。 小结 作为一种炎性细胞死亡模式,细胞焦亡通过激发抗肿瘤免疫反应而在肿瘤抑制中发挥重要作用。在某些情况下,单纯的细胞焦亡诱导就可能足以阻碍肿瘤生长。然而,细胞焦亡治疗应用面临的最大挑战之一是细胞焦亡相关成分的表达和功能的不规则性,不仅在不同的癌症之间,而且还存在于同一类型的癌症中。尽管如此,分子、遗传和表观遗传靶向/递送系统的进步,以及精准和个性化的医学的发展,让我们有希望很快能够利用这些强大机制作为治疗癌症的工具。来源:小药说药
肿瘤免疫与细胞焦亡

JITC:C反应蛋白先升后降,可能预示肺癌免疫治疗大获成功!

近年来,免疫治疗为晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者带来了曙光,但是并非所有患者都能从治疗中获益。因此,有效的生物标志物对于预测免疫治疗的疗效至关重要,PD-L1表达水平就是目前使用比较广泛的标志物,然而其预测性能还不够理想。于是研究者把目光投向了炎症,因为它在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用,例如常用的全身炎症标志物——C反应蛋白(CRP)。已有研究表明,CRP与多种恶性肿瘤的预后,及与接受免疫治疗的患者临床结局有关,可能成为免疫治疗的生物标志物,且在转移性肾细胞癌中,免疫治疗后CRP的动态变化与患者对治疗的应答有关。那么CRP的动态变化,是否也能预测NSCLC患者对免疫治疗的应答呢?带着这一问题,来自德国波恩大学医院的Tobias Bald教授领衔的团队开展了一项同时包含回顾性和前瞻性队列的研究,评估了CRP动态变化在接受免疫治疗的NSCLC患者中的预测价值,这项研究成果近日发表在《癌症免疫治疗杂志》(Journal of ImmunoTherapy for Cancer)上。研究发现,CRP的动态变化可以预测NSCLC患者对免疫治疗的反应,其中被定义为CRP突发反应,即CRP先升后降的患者,提示预后更好的总生存期(OS)等指标都明显更好,而且只需要动态检测CRP并随访4周,就能较为准确地预测疗效。研究人员纳入了接受免疫治疗的两个独立NSCLC患者队列:发现/回顾性队列(N=105)和验证/前瞻性队列(N=108)。检测这些患者在免疫治疗开始前30天内(基线水平)、后30天内和治疗过程中的血清CRP水平。根据CRP的动态变化情况,研究将患者分为三组:CRP突发反应者:CRP水平在免疫治疗后1个月内升高超过基线至少一倍,随后在3个月内下降至基线以下;CRP反应者:CRP水平在3个月内下降≥30%;其余为CRP无反应者。三组患者的年龄、性别等基线特征和PD-L1肿瘤比例评分(TPS)无统计学差异。在回顾性队列中,有31.4%(N=33)的患者为CRP无反应者,39.0%(N=41)为CRP反应者,29.5%(N=31)为CRP突发反应者。三组的中位无进展生存期(PFS)分别为2.6,12.1和9.2个月,中位OS分别为11.8,28.2和21.5个月。这提示CRP反应/突发反应与免疫治疗后的PFS和OS延长有关。回顾性队列中三组的中位PFS和OS为了验证这一结论,研究者们又分析了前瞻性队列中的数据。与回顾性队列有类似,前瞻性队列中有37.0%(N=40)的患者为CRP无反应者,36.1%(N=39)为CRP反应者,26.9%(N=29)为CRP突发反应者;三组的中位PFS分别为2.4,8.1和14.3个月,中位OS分别为6.6,18.6和32.9个月,与回顾性队列的发现基本一致。前瞻性队列中三组的中位PFS和OSCox回归分析显示,与CRP无反应者相比,CRP突发反应者的死亡风险降低了78%(HR=0.22, 95% CI: 0.10-0.48, p<0.001)。另外,三组的客观缓解率(ORR)也存在显著差异,分别为22.2%,44.4%和60.0%(p=0.0212)。前瞻性队列中三组的ORR以上两个独立队列的结果表明,免疫治疗后CRP的动态变化可以预测免疫治疗的疗效,并与NSCLC患者的预后相关。接下来,研究者们还分析了不同组织学类型的患者的CRP动态变化与免疫治疗疗效的关系,结果显示CRP的动态变化对腺癌和鳞癌都具有预测价值。值得注意的是,在前瞻性队列中,不管是在第几线接受免疫治疗,CRP的动态变化都与患者的预后相关,但是其对预后的影响在接受一线免疫治疗的患者中更为明显:与CRP无反应者相比,CRP突发反应者的进展和死亡风险降低了约90%。在两个队列中,大多数接受免疫+化疗的患者接受了含铂双药化疗,在回顾性队列中,只有少数患者(N=8)接受了阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗、卡铂和紫杉醇的治疗。研究者们注意到,CRP动态变化对同步化疗和同时使用糖皮质激素(泼尼松龙10mg或等效剂量的其它糖皮质激素)的患者没有预测价值。两个队列中三组患者对免疫治疗的反应CRP动态变化常规的分组间隔需要检测至免疫治疗12周后。但是研究者们发现,在前瞻性队列中,检测基线和免疫治疗开始后第1、2、4、6、10周的CRP水平,可以更详细地了解CRP的动态变化情况。免疫治疗后CRP水平的动态变化可以看出,CRP突发反应者的CRP水平在第1周内急剧升高,随后在4周左右下降至基线水平。在免疫治疗开始4周后,三分之二的CRP突发反应者和90%以上的CRP反应者已经可以被正确分类了。而且,当把观察期改为4周时,CRP的动态变化仍然可以预测免疫治疗的疗效。与常规的12周的观察期相比,4周的观察期可以更早期地预测患者对免疫治疗的反应。在临床上利用早期CRP动态变化,可以更早地协助医生评估疗效和调整治疗方案。早期CRP动态变化与患者预后的关系  A、B:所有患者;C、D:接受单药免疫治疗的患者总的来说,血清CRP水平可以预测NSCLC患者对PD-1/L1抑制剂治疗的反应和预后。将CRP动态变化的观察期改进为4周,可以提高CRP的早期预测能力和临床价值。血清CRP检测在临床上已经有广泛应用,因此早期CRP的动态变化有望成为一种易于确定、低成本和非侵入性的生物标志物,可以考虑对接受免疫治疗的NSCLC患者开展常规检测,后续也值得在其他肿瘤类型的患者中进一步研究。来源:奇点肿瘤探秘
JITC:C反应蛋白先升后降,可能预示肺癌免疫治疗大获成功!

p53:一种抗癌蛋白的曲折过去和充满希望的未来

当科学家在 1979年首次发现p53时,这是一个有趣但并非惊天动地的发现。 六个小组各自独立发现了一种分子量约为 53千道尔顿的细胞蛋白——p53因此得名。 p53似乎与一种名为猿猴病毒40的肿瘤诱导病毒相互作用,研究人员很快发现,被迫表达这种新克隆的p53基因的健康细胞很快就会癌变。 但事实要复杂得多。随着越来越多的研究人员开始研究 p53,很明显导致肿瘤的基因版本实际上发生了突变。这种基因在20世纪80年代从人类和小鼠身上克隆而来的未突变(即野生型)基因产生了完全相反的效果:这种基因起到了抑制肿瘤发生的作用。科学家甚至弄错了它的大小。 p53的真实分子量接近44千道尔顿。 在研究人员意识到这一点后的三十年里,p53的生物学意义变得越来越明显。这种蛋白质协调了一系列重要的细胞功能,其进化历史可以追溯到地球上一些最早的多细胞生命。大多数时候,p53在细胞中处于低水平的抑制状态,直到需要它为止。环境压力、异常代谢活动、遗传损伤和晚期衰老都可以触发蛋白质的激活,使 p53能够直接调节数百个基因的表达以启动适当的反应。 一些细胞危机可能是轻微的,需要一个专注于修复的反应来恢复细胞功能。然而,灾难性问题可能会导致细胞自毁以防止进一步的伤害。 这些功能使 p53成为抵御可能导致癌症的生物和环境损害的重要防御手段,因此一些人将这种蛋白质称为“基因组的守护者”。正如那些对TP53基因突变形式的早期研究所证明的那样,干扰p53功能的突变是众所周知的癌症驱动因素。大约一半的癌症与 p53突变有关,李-弗美尼综合征是一种罕见的遗传性疾病,有这种症状的人通常会有极高机率罹患各种肿瘤与癌症。即使 p53本身保持完整,其他因素也会使其受到束缚,并使细胞容易发生肿瘤。 尽管对 p53及其无数突变体的功能进行了大量研究,但仍然没有批准的药物可以选择性地靶向癌症中的p53途径。 但是有一些有希望的攻击途径,包括中和特定p53突变的破坏性影响或抵消在某些肿瘤中看到的p53过度抑制的分子。 这些和其他治疗方法的进一步进展以及精心挑选的联合疗法的识别,最终可能导致针对广泛的肿瘤类型取得重大胜利。 *中文翻译仅供参考,所有内容以新闻稿原文为准。
p53:一种抗癌蛋白的曲折过去和充满希望的未来

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